ĒST. Čudinovs, V.A. Platonovs, A.V. Aleksandrova, S.N. Elanskis
Nesen tika pierādīts, ka ascomycete sēne Ilyonectria crassa spēj inficēt kartupeļu bumbuļus. Šis darbs ir pirmais, kurā analizētas no kartupeļiem izolētā I. crassa celma bioloģiskās īpašības un rezistence pret dažiem fungicīdiem. “Kartupeļu” celma sugai raksturīgo reģionu secības sakrita ar tām, kas iegūtas iepriekš sēnēm, kas izolētas no narcises, žeņšeņa, apses un dižskābarža saknēm, liliju sīpoliem un tulpju lapām. Acīmredzot daudzi savvaļas un dārza augi var būt I. crassa rezerves. Izpētītais celms inficēja tomātu un kartupeļu šķēles, bet neinficēja visu tomātu augli un neskarto kartupeļu bumbuļus. Tas liecina, ka I. crassa ir brūču parazīts. Novērtējot rezistenci pret fludioksonilu, difenokonazolu un azoksistrobīnu uz uzturvielu barotnes, tika konstatēta šo zāļu augsta efektivitāte.
EC50 indekss (fungicīda koncentrācija, kas palēnina 2 reizes lielāku kolonijas radiālās augšanas ātrumu, salīdzinot ar nefungicīdu kontroli) bija vienāds ar 0.4; attiecīgi 7.4 un 4 mg / l. Veicot kartupeļu bumbuļu fitopatoloģisko novērtēšanu un augu aizsardzības pasākumu izstrādi, jāņem vērā I. crassa izraisītas slimības attīstības iespējamība.
Fitopatogēno mikroorganismu attīstība rada lielus zudumus visos kartupeļu audzēšanas un uzglabāšanas posmos. Plānojot aizsardzības pasākumus, parasti tiek ņemti vērā labi zināmi patogēni, piemēram, Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora uc ģints sugas. Tomēr pēdējos gados parādās arvien vairāk ziņojumu. par jaunu fitopatogēno mikroorganismu parādīšanos uz kartupeļiem. To bioloģija ir vāji pētīta, kartupeļiem lietoto fungicīdu efektivitāte attiecībā pret tiem nav zināma, diagnostikas metodes nav izstrādātas. Ar masīvu attīstību tie spēj nodarīt būtisku kaitējumu kartupeļu ražai. Viens no šiem mikroorganismiem ir ascomycete sēne Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, ko autori pirmo reizi atklāja uz kartupeļu bumbuļiem (Chudinova et al., 2019).
Šajā darbā ir sniegti no kartupeļu bumbuļa izolētā I. crassa celma analīzes rezultāti. Tika pētīta I. crassa koloniju un micēlija struktūru morfoloģija, sugai raksturīgo DNS reģionu nukleotīdu sekvences, virulence pret kartupeļiem un tomātiem un rezistence pret dažiem populāriem fungicīdiem.
materiāli un metodes
Mēs izmantojām I. crassa 18KSuPT2 celmu, kas izolēts 2018. gadā no skartā kartupeļu bumbuļa, kas audzēts Kostromas reģionā. Bumbuļus skārusi sausā puve ar dobumu, kas pārklāts ar gaiši brūnu micēliju. Izmantojot sterilu sadalīšanas adatu, sēnīšu micēlijs tika pārnests uz Petri trauciņu ar agara barotni (alus misa 10%, agars 1.5%, penicilīns 1000 U / ml). Plāksnes inkubēja tumsā 24 ° C temperatūrā.
Lai fotografētu, novērtētu sporu un sporu orgānu izmērus un morfoloģiju, tika izmantots Leica DM2500 gaismas mikroskops ar ICC50 HD digitālo kameru un Leica M80 binokulārais mikroskops ar IC80HD digitālo kameru (Leica Microsystems, Vācija).
Lai izolētu DNS, sēnīšu micēlijs tika audzēts šķidrā zirņu barotnē, pēc tam sasaldēts šķidrā slāpeklī, homogenizēts, inkubēts CTAB buferšķīdumā, attīrīts ar hloroformu un divas reizes mazgāts ar 2% spirtu.
DNS ekstrakcijas metode ir detalizēti aprakstīta Kutuzova et al rakstā. (2017).
Lai noteiktu sugu ar molekulārām metodēm un salīdzinātu ar citiem zināmiem I. crassa celmiem, tika veikta PCR ar praimeriem, kas ļāva amplificēt sugai raksturīgos DNS reģionus: ITS1-5,8S-ITS2 (praimeri ITS5 / ITS4, White et al., 1990), gēnu reģioni b -tubulīns (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) un translācijas pagarinājuma faktors 1α (tef1α) (primeri EF1-728F / EF1-986R, Carbone un Kohn, 1999). Vēlamā garuma amplikoni tika iegūti no gēla, izmantojot Evrogen CleanUp komplektu. Pastiprinātie reģioni tika sekvencēti, izmantojot BigDye® Terminator v3.1 cikla sekvencēšanas komplektu (Applied Biosystems, CA, ASV) uz Applied Biosystems 3730 xl automatizētā sekvencēra (Applied Biosystems, CA, ASV). Iegūtās nukleotīdu sekvences tika izmantotas, lai meklētu atbilstību ASV Nacionālā biotehnoloģijas informācijas centra (NCBI) GenBank datubāzē. Filoģenētiskā analīze tika veikta, izmantojot MEGA 6 programmu (Tamura et al., 2013).
Virulences noteikšana veikta veseliem zaļiem lielaugļu tomāta (šķirne Dubrava) un kartupeļu bumbuļiem (šķirne Gala). Turklāt tika izmantotas to pašu augļu un bumbuļu šķēles, lai imitētu bojāto augļu un bumbuļu bojājumus. Bumbuļu šķēles ievietoja mitrās kamerās, kas bija Petri trauciņi ar slapju filtrpapīru apakšā. Uz papīra tika uzlikts slaids, uz kura savukārt tika liktas bumbuļu vai augļu šķēles. Veselus bumbuļus un augļus ievietoja arī konteineros ar slapju filtrpapīru apakšā. Šķēles centrā (vai uz neskartas bumbuļa vai augļa virsmas) pēc 5 dienu augšanas uz misas agara ievietoja agara gabalu (5 × 5 mm) ar sēnīšu hifām.
Sēnīšu celmu rezistences pret fungicīdiem novērtējums tika veikts laboratorijas apstākļos uz agara barotnes. Mēs pētījām jutību pret fungicīdām zālēm Maxim, KS (aktīvā viela fludioksonils, 25 g / l), Quadris, KS (azoksistrobīns 250 g / l), Scor, EC (difenokonazols 250 g / l) (Valsts katalogs ..., 2020 ). Novērtēšana veikta Petri trauciņos uz misas-agara barotnes, pievienojot pētītās zāles aktīvās vielas koncentrācijās 0.1; 1; 10 ppm (mg / L) (fludioksonilam un difenokonazolam), 1; desmit; 10 ppm (azoksistrobīnam) un barotnēs bez fungicīda (kontrole). Fungicīdu pievienoja izkusušajai barotnei, kas atdzesēta līdz 100 ° C, pēc tam barotni ielej Petri trauciņos. Agara bloku ar sēnīšu micēliju ievietoja Petri trauciņa centrā un kultivēja 60 ° C temperatūrā tumsā. Pēc 24 dienu inkubācijas koloniju diametri tika izmērīti divos savstarpēji perpendikulāros virzienos; mērījumu rezultāti katrai kolonijai tika aprēķināti vidēji. Eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros. Pamatojoties uz analīžu rezultātiem, tika aprēķināts EC7, kas ir vienāds ar fungicīda koncentrāciju, kas uz pusi samazināja kolonijas radiālās augšanas ātrumu salīdzinājumā ar kontroli, kas nesatur fungicīdus.
Rezultāti un diskusija
Uz Petri trauciņiem ar misas agaru sēne veidoja kolonijas ar baltu flokulējošu micēliju. Barotne zem micēlija kļuva sarkanbrūna. Kad barotne izžūst, sēne veidoja divu veidu sporas uz atsevišķiem un apkopotiem konidioforiem mazās sporodohijās. Makrokonidijas ir iegarenas, cilindriskas, ar vienu līdz trim starpsienām, vidējais garums 27.2 µm ar vērtību diapazonu no 23.2 līdz 32.2 µm, platums līdz 4.9 µm (1. att.). Mikrokonīdiju vidējais garums ir 14.3 µm ar vērtību diapazonu no 10.3 līdz 18.1 µm, un platums ir līdz 4.0 µm. Visas makro- un mikromorfoloģiskās pazīmes iekļaujas sugas Ilyonectria crassa variāciju diapazonā (Cabral et al., 2012).
Sugai raksturīgo DNS reģionu sekvences (ITS, b-tubulīns, TEF 1α) pilnībā sakrita ar mūsu iepriekš pētīto I. crassa celmu sekvencēm (Chudinova et al., 2019, 1. tabula). Lai izpētītu I. crassa izplatību citos reģionos un analizētu skarto kultūru spektru, tika analizētas līdzīgas DNS sekvences GenBank datubāzē (1. tabula). Pārklāšanās bija 86 līdz 100%. Visu trīs “kartupeļu” I. crassa celma DNS reģionu sekvences bija identiskas to celmu sekvencēm, kas izolētas no lilijas sīpola un narcises saknēm Nīderlandē un no žeņšeņa saknes Kanādā. Mēs nevarējām atklātās datubāzēs atrast citus I. crassa celmus ar trim analizētām analogām sekvencēm. Tomēr nogulsnēto ITS un b-tubulīna secību analīze liecināja par I. crassa klātbūtni uz tulpju lapām Apvienotajā Karalistē. Sēnītes ar līdzīgu ITS secību tika identificētas, analizējot apses sakņu mikobiotu Kanādā un dižskābarža saknes Itālijā un kartupeļu bumbuļus Saūda Arābijā (1. tabula). Šī pētījuma rezultāti liecina, ka I. crassa ir globāla izplatība un spēj inficēt dažādas augu sugas.
Nosakot patogenitāti tomāta un kartupeļu šķēlītēm 5.dienā, bojājuma diametrs sasniedza 1.5 cm.Šajā gadījumā pētāmais celms neinficēja visu tomātu augli un neskarto kartupeļu bumbuļus. Tomēr tomātam tika ietekmētas kauslapiņas. Lai izslēgtu piesārņojuma iespēju, sēnīšu izolāts no micēlija, kas attīstījies uz kartupeļu bumbuļu šķēles, tika izolēts tīrkultūrā. Tas bija pilnīgi identisks vecāku celmam. Acīmredzot I. crassa ir brūču parazīts.
Sēklu bumbuļu apstrāde pirms stādīšanas ar fungicīdiem samazina slimību attīstību augiem veģetācijas periodā. Efektīvu fungicīdu izvēlei svarīgi izvērtēt, kuri no tiem ir efektīvi pret I. сrassa. Darbā tika pētītas plaši izplatītās fungicīdu aktīvās vielas - fludioksonils, azoksistrobīns, difenokonazols. Fludioksonils ir izveidots vairākos maisījumos, ko izmanto sēklu un sēklu bumbuļu apstrādei pirms stādīšanas. Fludioksonilu (Maxim) lieto arī sēklu bumbuļu apstrādei pirms uzglabāšanas. Difenokonazols un azoksistrobīns ir iekļauti arī vairākos preparātos, ko izmanto sēklas materiāla apstrādei, kā arī preparātos, kas paredzēti veģetatīvo augu apstrādei (Valsts katalogs ..., 2020).
I. crassa augšanas ātrums tika pētīts uz barotnēm (2. att.) ar dažādām aktīvo vielu koncentrācijām: fludioksonilu (EC50 = 0.4 ppm), azoksistrobīnu (EC50 = 4 ppm) un difenokonazolu (EC50 = 7.4 ppm) (2. tabula). ). Šos preparātus var uzskatīt par ļoti efektīviem pret I. crassa, jo to EC50 ir ievērojami zemāks par ieteicamo preparāta koncentrāciju bumbuļu apstrādei izmantotajā darba šķidrumā. Saskaņā ar Valsts katalogu ... (2020) fludioksonila koncentrācija kartupeļu bumbuļu apstrādes šķidrumā ir no 500 līdz 1000 ppm, azoksistrobīna (šķidrumā vagas dibena apstrādei) - 3750-9375 ppm, difenokonazola. (veģetatīvo augu apstrādes šķidrumā) - 187.5–625 ppm.
1. tabula. Genbank datubāzē pieejamo celma 18KSuPT2 un Ilyonectria crassa celmu sugai raksturīgo secību līdzība
Celms | Saimnieks augs, izdalīšanās vieta | GenBank noguldītie kārtas numuri, līdzību procentuālā daļa | Saite | ||
ITS | β-tubulīns | TEF 1α | |||
17KSPT1 un 18KSuPT2 | Kartupeļu bumbuļi, Kostromas reģions | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, šis darbs |
CBS 158/31 | Narcises saknes, Nīderlande | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Lilijas sīpols, Nīderlande | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Žeņšeņa sakne, Kanāda | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735/725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulpes lapa, Lielbritānija | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Dentona, Dentona, 2014 |
MT294410 | Apses saknes, Kanāda | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Dižskābardis, Itālija | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Tieša iesniegšana |
KAUF19 | Kartupeļu bumbuļi, Saūda Arābija | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = nav deponēts
2. tabula. Ilyonectria crassa rezistence pret fungicīdiem
(aktīvā viela) | EC50, ppm | ||||
3 diena | 5 diena | 7 diena | |||
Kontroli | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoksistrobīns) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioksonils) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EK (difenokonazols) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Mūsu darbā I. crassa celmi tika izolēti no kartupeļu bumbuļiem Kostromas un Maskavas (Chudinova et al., 2019) reģionos. Saūda Arābijas kartupeļu bumbuļu mikobiotas analīzē tika atklāts liels sēnīšu celmu īpatsvars ar ITS sekvencēm, kas ir identiskas I. crassa (Gashgari un Gherbawy, 2013). Acīmredzot I. crassa uz kartupeļiem nav tik reti sastopams, kā varētu šķist. Mūsu eksperimentos tika pierādīts, ka sēne var inficēt bojātos tomātu augļus. No literatūras ir zināms, ka I. crassa spēj attīstīties saprotrofiski augsnē (Moll et al., 2016), kā arī ietekmēt dažādus augus, pat taksonomiski attālus, piemēram, narcises, lilijas, žeņšeņus, apses, un dižskābardis (1. tabula). XNUMX). Acīmredzot daudzi savvaļas un dārza augi var būt I. crassa rezerves. Iepriekš minētais liecina, ka, izstrādājot aizsardzības pasākumus, ir jāņem vērā iespēja ar šo sēnīti ietekmēt kartupeļu bumbuļus. Plaši izplatītie preparāti kartupeļu bumbuļu ārstēšanai, kas satur fludioksonilu, azoksistrobīnu un difenokonazolu, ir pierādījuši augstu fungicīdu efektivitāti pret I. crassa.
Šo darbu atbalstīja Krievijas Fundamentālo pētījumu fonds (granta Nr. 20-016-00139).
Raksts publicēts žurnālā "Augu aizsardzības biļetens", 2020, 103 (3)