D. Ju. Rjazancevs, E. M. Čudinova, L. Ju. Kokajeva, S. N. Elanskis, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavrievs
Fitopatogēnā sēne Colletotrichum coccodes izraisa bīstamas kartupeļu un tomātu slimības, kas pazīstamas kā antraknoze un bumbuļu melnā vieta. Pēc morfoloģiskajām īpašībām tos bieži ir grūti atšķirt no citu mikroorganismu izraisītām slimībām; uz zaļo tomātu augļiem slimība var būt asimptomātiska, izpausties tikai uz nogatavojušiem sarkaniem augļiem. Lai ātri un precīzi diagnosticētu patogēnu, tiek piedāvāta reālā laika PCR testa sistēma. Lai izstrādātu testa sistēmu, tika noteikta 45 C. glicerīna trifosfāta dehidrogenāzes gēna nukleotīdu secība no dažādiem kartupeļiem no kartupeļu bumbuļiem izolētajos celmos dažādos Krievijas reģionos.
Pamatojoties uz iegūtajiem rezultātiem un citu sugu līdzīgu seku analīzi, kas ir pieejama GenBank datu bāzē, tika izstrādāti sugai specifiski grunti un C. coccodes zonde. Lai pārbaudītu izveidotās testa sistēmas specifiskumu, PCR veica ar DNS, kas izdalīta no 15 dažādu parazītu un saprotrofisko sēņu sugu kultūrām, kas saistītas ar tomātu un kartupeļu augiem (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Colletotrichum coccodes DNS klātbūtne tika noteikta pie sliekšņa cikla 20–27, savukārt citas sugas tika noteiktas pēc 40 cikliem vai netika atklātas. Pārbaudes sistēma ļauj droši noteikt C. coccodes DNS koncentrācijas, kas pārsniedz 0.01 ng / mm3 analizētajā PCR maisījumā. Izmantojot izstrādāto testa sistēmu, tika pētīta C. coccodes klātbūtne tomātu lapās ar sēnīšu slimību simptomiem un kartupeļu bumbuļos bez ārējiem slimības simptomiem. Lapas ar sēnīšu infekcijas simptomiem tika savāktas no diviem dažādiem laukiem Krasnodaras apgabalā, bumbuļi - no laukiem Kostromas, Maskavas, Kalugas, Ņižņijnovgorodas apgabalos. Krasnodaras apgabalā tika atrasta viena tomātu lapa, kas satur C. coccodes DNS; ievērojama šī patogēna DNS klātbūtne tika atklāta 5 bumbuļu paraugos, kas audzēti Kostromas, Maskavas, Kalugas apgabalos.
Ievads
Colletotrichum ģints sēnes ir bīstami fitopatogēni, kas ietekmē labību, dārzeņus, garšaugus, daudzgadīgus augļu un ogu augus. Viena no visuresošajām šīs ģints sugām Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hjūzs ir kartupeļu un tomātu antraknozes un melnās plankuma izraisītājs un izraisa virkni citu Solanaceae dzimtas augu, tai skaitā, slimības. nezāles (Dillard, 1992). C. coccodes inficē visas auga pazemes daļas, kātu pamatnes, lapas un augļus (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Uz inficēto kartupeļu bumbuļu mizas novēro pelēko plankumu veidošanos ar neskaidri izteiktām malām, uz kurām skaidri redzami melni sporulācijas un mikrosklerozes punkti. Uzglabāšanas laikā bumbuļu mīkstumā var veidoties čūlas ar mīkstinātu saturu, t.i. slimība nonāk antraknozes fāzē, kas tomēr notiek ārkārtīgi reti.
Tajā pašā laikā tomātu augļiem ir raksturīgi antraknozes (ādas čūlas ar maziem melniem punktiem) simptomi. Uz lapām C. coccodes simptomi parādās kā tumši brūni plankumi, kurus parasti ierobežo dzelteni audi (Johnson, 1994).
Melnās vietas rašanās uz bumbuļiem sabojā to izskatu, kas ir īpaši izteikta, pārdodot mazgātus sarkanās mizas kartupeļus. Mizas atslāņošanās izraisa pārmērīgu iztvaikošanu un palielina uzglabāšanas zudumus (Hunger, McIntyre, 1979). Citu augu orgānu bojājumi noved pie ražas zudumiem, kas tika atzīmēti gan atklātā, gan slēgtā augsnē (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). C. coccodes izraisītās slimības ir izplatītas gandrīz visos kartupeļu ražošanas reģionos pasaulē, ieskaitot Krieviju (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Šo slimību kontrole ir sarežģīta esošo fungicīdu nepietiekamās efektivitātes pret C. coccodes dēļ un rezistento šķirņu trūkuma dēļ (Read, Hide, 1995).
C. coccodes inoculum var saglabāties sēklu bumbuļos (Read and Hide, 1988; Johnson et al., 1997), tomātu sēklās (Ben-Daniel et al., 2010), ilgstoši izdzīvot augsnē, uz augu atliekām (Dillard, 1990 ; Dillard un Cobb, 1993) un nezālēs (Raid un Pennypacker, 1987). Vairāku autoru darbi (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) ir parādījuši, ka slimības attīstība kartupeļos un tomātos lielā mērā ir atkarīga no inokulāta klātbūtnes sēklās un augsne. Tāpēc, lai samazinātu slimības zaudējumus, ir nepieciešams diagnosticēt (ieskaitot kvantitatīvo) sēnīšu izplatīšanos sēklu materiālā, augsnē, sēklas kartupeļu bumbuļos un tomātu sēklās, kas novietotas uzglabāšanai. Morfoloģisko diagnostiku augsnē un augu materiālos var veikt tikai ar mikrosklerociju klātbūtni, kas tomēr sastopama arī cita veida sēnēs.
Simptomi uz bumbuļiem ir ļoti līdzīgi sudraba krevelei, ko izraisa sēne Helminthosporium solani. Colletotrichum coccodes un Helminthosporium solani izolēšana tīrā kultūrā ir diezgan sarežģīta un prasa ilgu laiku lēnas augšanas dēļ uzturvielu barotnē. Lai ātri identificētu Colletotrichum coccodes, ir jāizmanto instrumentālās diagnostikas metodes. Ērtākā metode ir polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) un tās modifikācija - reālā laika PCR. Pašlaik Eiropā un Amerikas Savienotajās Valstīs tiek izmantota Lielbritānijas pētnieku (Cullen et al., 2002) izstrādāta testa sistēma rDNS ITS1 reģionam. Tās izmantošana ir parādījusi labus rezultātus Krievijas izolātu analīzē (Belov et al, 2018). Tomēr C. coccodes ir ļoti mainīgs, un tā noteikšana no vienas DNS sekvences var izraisīt kļūdaini negatīvus rezultātus. Lai iegūtu ticamāku diagnozi, nepieciešams analizēt vairākas sugas specifiskas DNS sekvences, saistībā ar kurām esam izstrādājuši oriģinālu testa sistēmu, kas ļauj identificēt C. coccodes pēc gliceraldehīda-3-fosfāta dehidrogenāzes gēna secības.
materiāli un metodes
Lai novērtētu izveidoto testa sistēmu efektivitāti un specifiskumu, izmantojām tīras 15 sēņu sugu kultūras, kuras autori izdalīja no skartajiem tomātu, kartupeļu bumbuļu bumbuļu lapu un augļu paraugiem (1. tabula). Izolācijai mēs ņēmām augu orgānus ar sēnīšu infekcijas simptomiem, ne vairāk kā vienu orgānu uz krūmu.
Bumbuļa šķēle ar mizu, tomāta augļa šķēle un skartā lapa tika ievietota zem binokulārā mikroskopa, pēc kura micēlijs, sporas vai audu gabals tika pārnesti uz agara barotni (misas agars) Petri traukā ar asinātu izdalīšanas adatu. Izolātus uzglabāja uz agara slīpuma mēģenēs 4 ° C temperatūrā.
Tomātu lapu paraugus analīzei ar sēnīšu slimību simptomiem tūlīt pēc ražas novākšanas (uz lauka) ievietoja 70% etilspirtā, kurā tos turēja līdz DNS izolēšanai. Kartupeļu bumbuļi tika nogādāti laboratorijā, no tiem nomizoti (2 × 1 cm gabalā) un sasaldēti –20 ° С temperatūrā. Uzglabā saldētā veidā līdz DNS izolēšanai.
Tīras sēņu kultūras DNS izolēšanai audzēja šķidrā zirņu barotnē. Sēnes micēlijs tika noņemts no šķidras vides, žāvēts uz filtrpapīra, sasaldēts šķidrā slāpeklī, homogenizēts, inkubēts CTAB buferšķīdumā, attīrīts ar hloroformu, nogulsnēts ar izopropanola un 0.5 M kālija acetāta maisījumu, divas reizes mazgāts ar 2% spirta. Iegūto DNS izšķīdināja dejonizētā ūdenī un uzglabāja –70 ° С temperatūrā (Kutuzova et al., 20). DNS koncentrācija tika mērīta, izmantojot HS DNS kvantitatīvās noteikšanas komplektu divvirzienu DNS uz Qubit 2017 (Qiagen, Vācija). Alkoholizētos un sasaldētos paraugus triturēja šķidrā slāpeklī, pēc tam DNS ekstrakciju veica tāpat kā iepriekš aprakstīts (tīru sēņu kultūru micēlijam).
1. tabula. Izmantoto sēņu celmu izcelsme
Sēņu nosaukums | Augs, ērģeles | Atlases vieta |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | kartupeļu bumbulis | Kostromas apgabals, 1. lauka kartupeļu bumbuļi, šķirne Red Scarlett |
Colletotrichum cocccodes 4 | kartupeļu lapa | Rep. Mari El, Joshkar-Ola |
Helminthosporium solani | kartupeļu bumbulis | Magadanas reģions, poz. Telts, kartupeļu bumbulis |
Cladosporium fulvum | tomātu lapa | Maskavas apgabals, lielaugļu tomāts |
Alternaria tomatophila | tomātu augļi | iesniedza Viskrievijas Augu aizsardzības pētniecības institūta mikoloģijas un fitopatoloģijas laboratorijas darbinieki |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | tomātu augļi | Krasnodaras teritorija, Krymsky rajons, krēms |
Fusarium oxysporum | kviešu sakne | Maskavas apgabals |
PCR tika veikts ar DTprime pastiprinātāju (DNS-Technology). PCR veikšanai tika izmantoti oriģinālie grunti un zonde glicerīna trifosfāta dehidrogenāzes gēna sugai raksturīgajam reģionam: uz priekšu esošais grunts Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, reversais grunts Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1). Gruntskrāsas pastiprina 213 bp lielu reģionu.
Reakcijai bija nepieciešams 50 ng kopējās DNS (analizējot lapas un bumbuļus) un 10 ng (analizējot tīru sēnīšu kultūru DNS). Reakcijas maisījumu (35 μl) ar parafīna slāni atdalīja divās daļās: apakšējā (20 μl) bija 2 μl 10 × reakcijas bufera (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM katra dezoksinukleotīda trifosfāta, 7 pmol katra grunts un 4 pmol hidrolizējamas fluorescējošas zondes; augšējais saturēja 1 μl 10 × PCR buferšķīduma un 1 U Taq polimerāzes.
Maisījuma atdalīšana ar parafīnu ļauj caurules ilgstoši uzglabāt 5 ° C temperatūrā un nodrošināt karstu palaišanu PCR pēc 10 minūšu karsēšanas temperatūrā virs 80 ° C. PCR tika veikts saskaņā ar šādu programmu: 94.0 ° C - 90 s (1 cikls); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 cikli); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 cikli); 10.0 ° C - uzglabāšana.
Rezultāti un diskusija
Glicerīna trifosfāta dehidrogenāzes gēna secības tika noteiktas 45 celmos, kas izolēti no lapām, kātiem, kartupeļu bumbuļiem un tomātu augļiem (Kutuzova, 2018) dažādos Krievijas reģionos. Pētītās visu celmu secības tika sadalītas 2 grupās, kas atšķiras divos nukleotīdos. Abu grupu pārstāvju nukleotīdu sekvences ar numuriem KY496634 un KY496635 tiek deponētas GenBank.
Uz to bāzes projektētie grunti coc70gdf, coc280gdr un cocgdz zonde tika pārbaudīti, izmantojot programmu BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) par visām Colletotrichum ģints sugu un citu GenBank datu bāzē pieejamo organismu glicerīna trifosfāta dehidrogenāzes gēna sekvencēm.
Netika atrasti citu organismu DNS reģioni, kas būtu ļoti homoloģiski primeriem un zondei.
Pārbaudes sistēmas jutīgums tika pārbaudīts, izmantojot paraugus ar atšķirīgu C. coccodes DNS koncentrāciju, ar antraknozi inficētas kartupeļu lapas DNS (savākta 2017. gadā Mari El, šķirne Red Scarlett) un melno plankumu skarto bumbuļu mizu (savākta Kostromas reģionā, šķirne Red Scarlett, 2. tabula). Lai apstiprinātu DNS klātbūtni bumbuļos un kartupeļu lapās, C. coccodes celmus no tiem izolēja tīrā kultūrā.
Testa sistēmas jutīguma analīzes rezultāti rāda, ka to var izmantot, lai veiksmīgi diagnosticētu C. coccodes DNS klātbūtni paraugā, ja tā kopējais saturs PCR maisījumā ir lielāks par 0.05 ng. Tas ir pilnīgi pietiekams noteikšanai, jo viena sklerotija satur vidēji 0.131 ng un viena spora satur apmēram 0.04 ng DNS (Cullen et al., 2002). Angļu grupas izstrādātā testa sistēma (Cullen et al., 2002) parādīja līdzīgu jutīgumu (sliekšņa cikls 34 pie 0.05 ng DNS un 37 pie 0.005 ng).
Dabisko paraugu, kas satur C. coccodes, analīze visos gadījumos ļāva droši atklāt tā klātbūtni paraugā (2. tabula). Piedāvātā metode DNS izolēšanai bija piemērojama arī dabisko augu paraugu analīzei.
2. tabula. Ierosinātās testa sistēmas jutīguma noteikšana Colletotrichum kokkoku identificēšanai reālā laika PĶR
paraugs | DNS daudzums paraugā *, ng | Sliekšņa cikls | C. kokcodu noteikšana |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Bumbuļu miza 1 | 50 | 32 | + |
Bumbuļu miza 2 | 50 | 30 | + |
Bumbuļu miza 3 | 50 | 31.5 | + |
Kartupeļu lapa | 50 | 29.5 | + |
Piezīme. * PCR produktu maisījumā.
Pārbaudes sistēmas specifiskumu pārbaudīja ar DNS paraugiem, kas ekstrahēti no 15 sēņu sugām. Autori izolēja visus sēņu celmus no ietekmētiem un veselīgiem tomātu augļiem un lapām, kartupeļu bumbuļiem; vienu celmu izolēja no kviešu saknēm (1. tabula). Starp tiem, kas izolēti no augļa virsmas, ir sugas, kas nav patogēnas tomātiem (piemēram, Phellinus ferrugineovelutinus).
Pētījumi ir parādījuši, ka C. coccodes DNS tika atklāts pie sliekšņa cikla 20–27, savukārt citas sēnīšu sugas netika atklātas vai deva signālu pēc 40. cikla, ko var attiecināt uz nespecifisku trokšņa efektu (3. tabula).
3. tabula. Pārbaudes sistēma dažādu sēņu veidiem
Sēņu nosaukums | Sliekšņa cikls |
Colletotrichum kokodi 1 | 20.9 |
C. kokodi 2 | 22.6 |
C. kokodi 3 | 23 |
C. kokodi 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Piezīme. * DNS daudzums visos paraugos bija 10 ng.
Izstrādāto testa sistēmu izmantoja, lai identificētu C. coccodes tomātu lapu paraugos ar nekrotrofisko patogēnu un sēklu kartupeļu bumbuļu simptomiem bez redzamiem simptomiem. Pētījumam paņēmām dažādu šķirņu sēklu bumbuļus, kas audzēti Kostromas, Maskavas, Kalugas, Ņižņijnovgorodas apgabalos. C. coccodes DNS klātbūtne tika uzskatīta par nozīmīgu paraugos, kuru analīzē sliekšņa cikls nepārsniedza 35. Šī sliekšņa vērtība tika izvēlēta, pamatojoties uz ticamu 0.05 ng C. coccodes DNS noteikšanu (sliekšņa cikls 33.5, 2. tabula) un to, ka pie sliekšņa cikliem virs 40 tika diagnosticēta nespecifiska dažu citu sēņu sugu DNS. Ar šo pieeju ievērojama C. coccodes DNS klātbūtne tika atklāta 5 bumbuļu paraugos, kas audzēti Kostromas, Maskavas, Kalugas apgabalos, un vienā tomātu lapā no Krasnodaras apgabala Yeisk rajona (4., 5. tabula).
4. tabula. Colletotrichum kokkoku noteikšana kartupeļu bumbuļos *
Parauga numurs | Kartupeļu šķirne | Augšanas vieta | C. kokcodu noteikšana | Sliekšņa cikls |
---|---|---|---|---|
1 | Sarkanā Scarlet | Kostromas reģions | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Santē | Maskavas apgabals | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Žukovska agri | Maskavas apgabals | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga reģiona. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantāzija | Kaluga reģiona. | - | |
15 | Gala | Nizhny Novgorod reģionā. | - | |
16 | - |
Piezīme. * DNS daudzums visos paraugos bija 50 ng.
5. tabula. Colletotrichum kokkoku noteikšana uz tomātu lapām *
Parauga numurs | Augšanas vieta | C. kokcodu noteikšana | Sliekšņa cikls |
---|---|---|---|
1 | Krasnodaras teritorija, Krimas apgabals | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodaras apgabals, Yeisk rajons | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* DNS daudzums visos paraugos bija 50 ng.
Mūsu izveidotā testa sistēma jutīguma un specifiskuma ziņā nav zemāka par britu pētnieku (Cullen et al., 2002) izstrādāto un ir piemērota augu paraugu analīzei. Tā izmantošana sēklu bumbuļu analīzei ļāva identificēt bumbuļos esošo C. coccodes DNS bez ārējām bojājumu pazīmēm un veiksmīgi analizēt lapu infekciju.
Līdz šim Krievijā nav veikta kartupeļu bumbuļu analīze attiecībā uz C. coccodes invāziju. Mūsu pirmais pētījums parādīja, ka no 16 pārbaudītajiem sēklu bumbuļiem, kas audzēti dažādos Krievijas Federācijas reģionos, 5 satur C. coccodes. Tas parāda, ka kartupeļu bumbuļu melnā vieta Krievijā ir izplatīta kartupeļu slimība, un tās loma kartupeļu ražas apjoma un kvalitātes samazināšanā netiek novērtēta.
Tomātu lapu analīze atklāja ievērojamu C. coccodes DNS klātbūtni vienā lapā no Krasnodaras apgabala Yeisk rajona. Iepriekš, pārbaudot tomātu laukus Krievijas dienvidos, izmantojot Lielbritānijas testa sistēmu (Cullen et al., 2002), tika atrastas lapas, kas satur C. coccodes, un dažos laukos tika konstatēta liela daļa ar C. coccodes inficēto lapu (Belov et al. 2018). Maskavas apgabala Krasnodaras un Primorskas apgabalos mēs atradām tomātu augļus, no kuriem mums izdevās izolēt tīras C. coccodes kultūras. Iespējams, ka Krievijā C. coccodes tomātos ir daudz izplatītāks nekā tagad tiek uzskatīts, un arī tā kaitīgums tiek novērtēts par zemu.
Tādējādi līdz šim ir uzkrāta pietiekami daudz informācijas par C. coccodes plašo izplatību kartupeļos un tomātos.
Lai labāk izprastu šīs sēnītes nozīmi kartupeļu un tomātu slimību attīstībā, ir nepieciešams plaši uzraudzīt tās izplatību Krievijā, izpētīt augsnes un sēklu infekcijas lomu un melnās vietas lomu zudumos uzglabāšanas laikā. PĶR diagnostikas izmantošana var ievērojami atvieglot šo darbu, un vienlaicīga abu testēšanas sistēmu izmantošana ievērojami palielinās analīzes precizitāti.
Šo darbu atbalstīja Krievijas Zinātnes fonda dotācija Nr. 18-76-00009.
Raksts tika publicēts žurnālā Mycology and Fitopathology (54. sējums, 1. gada 2020. nr.).