S.N. Elansky, L.Yu. Kokajeva, N.V. Statsjuk, Yu.T. Djakovs
Ievads
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - vēlīnās pūtes izraisītājs, ekonomiski vissvarīgākā kartupeļu un tomātu slimība - vairāk nekā pusotra gadsimta laikā ir piesaistījis dažādu valstu pētnieku uzmanību. Pēkšņi parādoties Eiropā XNUMX. gadsimta vidū, tas izraisīja kartupeļu epidēmiju, kas palikusi daudzu paaudžu atmiņā.
Līdz šim to bieži sauc par "īru bada sēni". Gandrīz simts gadus pēc pirmajām epidēmijām tika atklātas Meksikas savvaļas kartupeļu sugas, kas izturīgas pret vēlu iedegu, tika izstrādātas metodes to šķērsošanai ar kultivētiem kartupeļiem (Muller, 1935), un tika iegūtas pirmās vēlīnai pūtītei izturīgās šķirnes (Pushkarev, 1937). Tomēr drīz pēc to komerciālās audzēšanas sākuma uzkrājās vēlīnās sērgas patogēnu sacīkstes, kas bija izturīgas pret izturīgām šķirnēm. un jaunu Meksikas savvaļas kartupeļu rezistences gēnu ieviešana šķirnēs sāka ātri zaudēt efektivitāti.
Neveiksmes, lietojot monogēnu (vertikālu) pretestību, audzētājiem lika meklēt sarežģītākus nespecifiskās poligēnās (horizontālās) pretestības izmantošanas veidus. Pēdējos gados atsevišķās parazītu populācijās ir sākušas uzkrāties ļoti agresīvas rases, kas izraisa pat nespecifiskas pretestības eroziju. Fungicīdu rezistentu celmu parādīšanās ir radījusi problēmas kartupeļu aizsardzības ķīmisko vielu lietošanā.
Sakarā ar ievērojamām oomicetu un sēņu atšķirībām ķīmiskajā sastāvā, ultrastruktūrā un metabolismā, fungicīdi, īpaši sistēmiskie, kurus izmanto augu aizsardzībai no daudzām sēnīšu slimībām, ir neefektīvi pret oomicetiem.
Tāpēc ķīmiskajā aizsardzībā pret vēlo puvi tika izmantota daudzkārtēja (līdz 12 reizēm sezonā vai vairāk) izsmidzināšana ar plaša darbības spektra kontakta preparātiem. Revolucionārs solis bija fenilamīdu izmantošana, kas ir toksiski oomicetiem un sistemātiski izplatās augos. Tomēr to plašā izmantošana ātri noveda pie rezistentu celmu uzkrāšanās sēnīšu populācijās (Davidse et al., 1981), kas ievērojami sarežģīja augu aizsardzību. P. infestans ir praktiski vienīgais mērenās zonas parazīts, kura kaitējumu bioloģiskajā lauksaimniecībā nevar neitralizēt, neizmantojot ķīmiskus aizsardzības līdzekļus (Van Bruggen, 1995).
Iepriekš aprakstītais izskaidro lielo uzmanību, ko dažādu valstu pētnieki pievērš P. infestans populāciju izpētei, to pārpilnības un ģenētiskā sastāva dinamikai, kā arī mainīguma ģenētiskajiem mehānismiem.
R. INFESTĀNA dzīves cikls
Oomycete Phytophthora infestans kartupeļu lapu iekšpusē izveido starpšūnu micēliju ar haustoriju. Barojoties ar lapu audiem, tas izraisa tumšu plankumu veidošanos, kas mitrā laikā pūst un puvi. Ar spēcīgu sakāvi visa lapa mirst. Pēc barošanas perioda uz micēlija veidojas izaugumi - sporangiofori -, kas caur stomātiem izaug uz āru. Mitrā laikā tie veido baltu ziedu ap plankumiem lapu apakšpusē. Sporangioforu galos veidojas citrona formas zoosporangijas, kas nolūst un tiek pārnestas ar lietus izsmidzināšanu (1. att.). Nokrītot ūdens pilēs uz kartupeļu lapas virsmas, sporangijas dīgst ar 6-8 zoosporām, kuras pēc kustības perioda ir noapaļotas, pārklātas ar membrānu un dīgstas ar dīgļu cauruli. Asns caur stomātiem iekļūst lapu audos. Noteiktos apstākļos sporangijas augšanas mēģenē var izaugt tieši lapu audos. Labvēlīgos apstākļos laiks no infekcijas līdz jaunas sporulācijas veidošanai ir tikai 3-4 dienas.
Sporangijas, nonākot zemē un filtrētas caur augsni, spēj inficēt bumbuļus. Smagi skartie bumbuļi uzglabāšanas laikā sapūst; vāji ietekmētajā infekcija var turpināties līdz nākamajai sezonai. Turklāt vēlīnās drudzes izraisītājs ziemā var saglabāties oosporu (biezu sienu miera dzimumorgānu) veidā augsnē uz augu atliekām un uz tomātu sēklām. Oosporas veidojas uz dzīvu augu orgāniem, kad dažādu pārošanās veidu celmi saskaras ar pārmērīgu mitrumu. Pavasarī uz stādītiem inficētiem bumbuļiem un augu atliekām ar oosporām veidojas nedzimta sporulācija; zoosporas nonāk augsnē un izraisa augu apakšējo lapu inficēšanos. Dažos gadījumos micēlijs var izaugt no inficētā bumbuļa gar augu zaļo daļu un parasti parādās kāta augšdaļā.
Būtiska atšķirība starp oomicetēm un lielāko daļu sēnīšu slēpjas diplofāžu pārsvarā to dzīves ciklā ar gametisko mejozi un zigotu (oosporu) dīgtspēju bez reduktīvas kodola dalīšanās. Šī iezīme, kā arī biseksuālismu aizstājošais dipolārais heterotālisms, šķiet, ļautu piemērot oomicetēm pieejas, kas izstrādātas augstāku eikariotu populāciju izpētei (panmixia un populāciju sadalījuma analīze, intra- un interpopulation gēnu plūsmas utt.). Tomēr trīs faktori neļauj pilnībā pārnest šīs pieejas, pētot P. infestans populācijas.
1. Kopā ar hibrīdu oosporām populācijās veidojas pašauglīgas un partenogenētiskas oosporas (Fife un Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), un to veidošanās biežums var būt pietiekams, lai ietekmētu par testa rezultātiem.
2. P. infestans dzimuma process nenozīmīgi veicina populācijas lieluma dinamiku, jo sēne vairojas galvenokārt veģetatīvās sporas veidā, veidojot vairāk nekā 90% pārošanās veida analīzes rezultātu ar tradicionālo metodi uz barības vielas ... veģetācijas periodā vairākas paaudzes bezdzimuma sporulācijas (policiklisko slimību attīstība). Oosporām ir svarīga loma organisma saglabāšanā periodā, kad nav zaļo augu (ziemā), un primārajā stādu inficēšanā. Tad vasaras laikā notiek klonu reprodukcija un seksuālās rekombinācijas rezultātā radušos atsevišķu klonu skaita pieaugums vai, gluži pretēji, samazinājums, ko galvenokārt nosaka pielāgotāko atlase. Tāpēc atsevišķu klonu attiecība populācijā epifitotikas sākumā un beigās var būt pilnīgi atšķirīga.
3. Aprakstītais cikls ir raksturīgs P. infestans vietējām populācijām viņu dzimtenē, Centrālamerikā. Citās pasaules vietās seksuālais process nebija zināms vairāk nekā 100 gadus; veģetatīvā micēlija inficētajos kartupeļu bumbuļos bija ziemošanas posms. Dzīves cikls bija pilnīgi agams, un izplatībai bija fokusa raksturs: infekcija no atsevišķiem inficētiem stādītiem bumbuļiem pārgāja uz lapām, veidojot primāros slimības perēkļus, kas masveida slimības attīstības laikā varēja apvienoties.
Tādējādi dažos reģionos var mainīties seksuālie un aseksuālie cikli, savukārt citos - tikai bezdzimuma cikli.
P. INFESTANS izcelsme
P. infestans Eiropā parādījās 1991. gadsimta pirmās puses beigās. Tā kā kartupeļu dzimtene ir Dienvidamerikas ziemeļaustrumi, tika pieņemts, ka parazīts no turienes uz Eiropu tika atvests Čīles salvetes uzplaukuma laikā. Tomēr pētījumi, kas veikti Rokfellera centra kartupeļu stacijā Tolukas ielejā, Meksikā, lika šo viedokli pārskatīt (Niederhauser 1993, XNUMX).
1. Tolukas ielejā vietējām bumbuļveida kartupeļu sugām (Solanum demissum, S. bulbocastanum u.c.) ir dažādi gēnu komplekti vertikālajai rezistencei apvienojumā ar augstu nespecifiskās rezistences līmeni, kas norāda uz ilgstošu evolūciju ar parazītu. Dienvidamerikas sugām, ieskaitot kultūraugu kartupeļus, trūkst rezistences gēnu.
2. Tolukas ielejā ir sastopami izolāti ar A1 un A2 pārošanās tipiem, kā rezultātā ir plaši izplatīta P. infestans starpkultūru populācija; kamēr kultivēto kartupeļu dzimtajā zemē, Dienvidamerikā, parazīts izplatās klonāli.
3. Tolukas ielejā ik gadu notiek smagas vēlīnās pūtes epidēmijas. Tāpēc starp Ziemeļamerikas pētniekiem (Kornela universitāte) ir izveidojies viedoklis par Mesoamerica (Centrālamerika) kā kartupeļu fitoftoras dzimteni (Goodwin et al., 1994).
Dienvidamerikas pētnieki nepiekrīt šim viedoklim. Viņi uzskata, ka kultivētajam kartupelim un tā parazītam P. infestans ir kopīga dzimtene - Dienvidamerikas Andi. Viņi atbalstīja savu viedokli, veicot molekulārus pētījumus par mitohondriju genoma (mtDNS) un kodola gēnu RAS un β-tubulīna DNS polimorfismu analīzi (Gomez-Alpizar et al., 2007). Viņi parādīja, ka celmi, kas savākti no dažādām pasaules daļām, cēlušies no trim atšķirīgām senču līnijām, kuras (visas trīs) ir sastopamas Dienvidamerikas Andos. Andu haplotipi ir divu līniju pēcteči: vecākās mtDNS līnijas izolāti ir sastopami savvaļā augošajos Solanaceae no Anarrhicomenum sekcijas Ekvadorā, savukārt otrās līnijas izolāti ir izplatīti kartupeļos, tomātos un savvaļas nakteņos. Tolukā pat reti haplotipi ir cēlušies tikai no vienas cilts, un Toluka celmu ģenētiskā mainība (dažu mainīgo vietu zema alēliskā frekvence) norāda uz spēcīgu dibinātāja efektu nesenās dreifēšanas dēļ.
Turklāt Andos tika atrasta jauna P. andina suga, morfoloģiski un ģenētiski līdzīga P. infestans, kas, pēc autoru domām, norāda uz Andiem kā Phytophthora ģints speciācijas karsto vietu. Visbeidzot, Eiropā un Amerikas Savienotajās Valstīs P. infestans populācijā ietilpst abas Andu līnijas, savukārt Tolukā tikai viena.
Šī publikācija izraisīja dažādu valstu pētnieku grupas atbildi, kuri veica daudz eksperimentālu darbu, lai pārskatītu iepriekš veikto pētījumu (Goss et al., 2014). Šajā darbā, pirmkārt, DNS polimorfismu izpētei tika izmantotas informatīvākas mikrosatelītu DNS sekvences; otrkārt, klasteru, migrācijas ceļu, iedzīvotāju laika atšķirību uc analīzei. Tika izmantoti progresīvāki modeļi (F-statistika, Bajesa aproksimācijas utt.) un, treškārt, salīdzinājums tika izmantots ne tikai ar Andu sugām P. andina, kurā tika izveidota hibrīda daba (P. infestans x Phytophthora sp.) bet arī ar Meksikas endēmiskajām sugām P. mirabilis, P. Ipomoeae un Phytophthora phaseoli, kas ir ģenētiski tuvi P. infestans, kas iekļauti tajā pašā klajā (Kroon et al., 2012). Šo analīžu rezultātā nepārprotami tika parādīts, ka visu pētījumā ņemto Phytophthora ģints sugu filoģenētiskā koka sakņu daļa, izņemot P. andina hibrīdu, pieder pie Meksikas celmiem, un migrācijas plūsmai ir Meksikas - Andu virziena virziens, nevis otrādi, un tās sākums sakrīt ar Eiropas Jaunās pasaules kolonizācija (pirms 300-600 gadiem). Tādējādi P. infestans sugas, kas specializējušās kartupeļu sakāvei, parādīšanās notika bumbuļainu nakteņu veidošanās sekundārajā ģenētiskajā centrā, t.i. Centrālamerikā.
P. INFESTANS genoms
2009. gadā starptautiska zinātnieku komanda sekvencēja pilnīgu P infestans genomu (Haas et al, 2009), kura lielums bija 240 MB. Tas ir vairākas reizes vairāk nekā cieši saistītās sugās P. sojae (95 Mb), kas izraisa sojas sakņu puvi, un P. Ramorum (65 Mb), ietekmējot tādas vērtīgas koku sugas kā ozols, dižskābardis un dažas citas. Iegūtie dati parādīja, ka genomā ir liels atkārtotu secību kopiju skaits - 74%. Genomā ir 17797 olbaltumvielas kodējoši gēni, no kuriem lielākā daļa ir gēni, kas iesaistīti šūnu procesos, ieskaitot DNS replikāciju, olbaltumvielu transkripciju un tulkošanu.
Salīdzinot Phytophthora ģints genomus, tika atklāta neparasta genoma organizācija, kas sastāv no konservētu gēnu secību blokiem, kuros gēnu blīvums ir salīdzinoši augsts, un atkārtotu secību saturs ir salīdzinoši zems, un atsevišķi reģioni ar nekonservētām gēnu sekvencēm, ar zemu gēnu blīvumu un lielu atkārtotu reģionu saturu. Konservatīvie bloki veido 70% (12440) no visiem P. infestans proteīnus kodējošajiem gēniem. Konservatīvos blokos gēni parasti ir cieši izvietoti ar vidējo starpģēnu attālumu 604 bp. Teritorijās starp konservatīvajiem blokiem starpģēnu attālums ir lielāks (3700 bp) atkārtojošos elementu blīvuma palielināšanās dēļ. Ātri attīstošie sekrēcijas sekrēcijas gēni atrodas gēnu nabadzīgos reģionos.
P. Infestans genoma secības analīze parādīja, ka aptuveni viena trešdaļa genoma pieder transponējamiem elementiem. P. infestans genomā ir ievērojami vairāk dažādu transposonu ģimeņu nekā citos zināmos genomos. Lielākā daļa P. infestans transposonu pieder čigānu ģimenei.
P. infestans genomā ir identificēts liels skaits specifisku gēnu ģimeņu, kas iesaistītas patoģenēzē. Ievērojama daļa no tiem kodē efektorproteīnus, kas maina saimniekauga fizioloģiju un veicina tā infekciju. Tie pieder divām lielām kategorijām: apoplastiskajiem efektoriem, kas darbojas starpšūnu telpās (apoplastos), un citoplazmas efektoriem, kas šūnās nonāk caur haustoria. Apoplastiskajos efektoros ietilpst sekrēti hidrolītiski fermenti, piemēram, proteāzes, lipāzes un glikozilāzes, kas iznīcina augu šūnas; saimniekaugu aizsardzības enzīmu inhibitori un nekrotizējoši toksīni, piemēram, Nep1 līdzīgi proteīni (NPL) un Pcf līdzīgi mazie ar cisteīnu bagāti proteīni (SCR).
P. infestans effektoru gēnu ir daudz un parasti tie ir lielāki nekā nepatogēnie gēni. Vispazīstamākie ir citoplazmas efektori RXLR un Crinkler (CNR). Oomicetu tipiskie citoplazmas efektori ir RXLR proteīni. Visi līdz šim atklātie RXLR efektorgēni satur aminoterminālo grupu Arg-XLeu-Arg, kur X ir aminoskābe. Pētījuma rezultātā tika ierosināts, ka P. infestans genomā ir 563 RXLR gēni, kas ir par 60% vairāk nekā P. sojae un P. ramorum. Aptuveni puse no P. infestans genomā esošajiem RXLR gēniem ir sugām raksturīgi. RXLR efektoriem ir ļoti dažādas sekvences. Starp tiem tika identificēta viena daudzbērnu un 150 maza ģimene. Atšķirībā no galvenā proteoma, RXLR efektorgēni parasti atrodas gēnu nabadzīgajos un atkārtoti bagātajos genoma reģionos. Mobilie elementi, kas nosaka šo reģionu dinamiku, veicina šo gēnu rekombināciju.
Citoplazmas CRN efektori sākotnēji tika identificēti P. infestans stenogrammās, kas kodē augu audu nekrozes peptīdus. Kopš to atklāšanas ir maz zināms par šo efektoru saimi. Analizējot P. Infestans genomu, tika atklāta milzīga 196 CRN gēnu saime, kas ir ievērojami lielāka nekā P. sojae (100 CRN) un P. ramorum (19 CRN). Tāpat kā RXLR, CRN ir moduļu olbaltumvielas un sastāv no ļoti konservēta N-termināla LFLAK domēna (50 aminoskābes) un blakus esoša DWL domēna, kas satur dažādus gēnus. Lielākajai daļai CRN (60%) ir signālpeptīds.
Ir pētīta dažādu CRN iespēja izjaukt saimniekauga šūnu procesus. Analizējot augu nekrozi, CRN2 olbaltumvielu noņemšana ļāva identificēt C-termināla reģionu, kas sastāv no 234 aminoskābēm (173.-407. Pozīcija, DXG domēns) un izraisa šūnu nāvi. P. infestans CRN gēnu analīze atklāja četrus dažādus C-termināla reģionus, kas arī izraisa šūnu nāvi augā. Tie ietver nesen identificētos DC domēnus (P. Infestansam ir 18 gēni un 49 pseidogēni), kā arī D2 (14 un 43) un DBF (2 un 1) domēnus, kas ir līdzīgi olbaltumvielu kināzēm. Augā ekspresētie CRN domēnu proteīni tiek saglabāti (ja nav signālpeptīdu) augu šūnā un stimulē šūnu nāvi ar intracelulāru mehānismu. Vēl 255 sekvences, kas satur CRN domēnus, visticamāk, nedarbojas kā gēni.
RXLR un CRN efektoru gēnu ģimeņu skaita un lieluma pieaugumu, domājams, izraisīja paralēlā homoloģiskā rekombinācija un gēnu dublēšanās. Neskatoties uz to, ka genoms satur lielu skaitu aktīvo mobilo elementu, joprojām nav tiešu pierādījumu par efektorgēnu pārnešanu.
Iedzīvotāju struktūras izpētē izmantotās metodes
Populāciju ģenētiskās struktūras izpēte pašlaik balstās uz tās sastāvdaļu celmu tīru kultūru analīzi. Populāciju analīze, neizolējot tīras kultūras, tiek veikta arī īpašiem mērķiem, piemēram, piemēram, pētot populācijas agresivitāti vai pret fungicīdiem rezistentu celmu klātbūtni tajā (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Šāda veida pētījumi ietver īpašu metožu izmantošanu, kuru apraksts pārsniedz šī pārskata darbības jomu. Celmu salīdzinošai analīzei tiek izmantotas vairākas metodes, kuru pamatā ir gan DNS struktūras analīze, gan fenotipisko izpausmju izpēte. Salīdzinošai populāciju analīzei jātiek galā ar lielu skaitu izolātu, kas nosaka noteiktas prasības izmantotajām metodēm. Ideālā gadījumā viņiem jāatbilst šādām prasībām (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- jābūt lētam, viegli īstenojamam, neprasa ievērojamus laika izdevumus, balstoties uz vispārpieejamām tehnoloģijām (piemēram, PCR);
- jārada pietiekami liels skaits neatkarīgu kodominantu marķieru pazīmju;
- ar augstu reproducējamību;
- izmantot minimālo pārbaudāmo audu daudzumu;
- jābūt specifiskam substrātam (kultūrā esošajam piesārņojumam nevajadzētu ietekmēt rezultātus);
- neprasa izmantot bīstamas procedūras un ļoti toksiskas ķīmiskas vielas.
Diemžēl nav metožu, kas atbilstu visiem iepriekš minētajiem parametriem. Mūsdienu celmu salīdzinošam pētījumam tiek izmantotas metodes, kuru pamatā ir fenotipisko īpašību analīze: virulence pret kartupeļu un tomātu šķirnēm (kartupeļu un tomātu rases), pārošanās veids, peptidāzes izoenzīmu un glikozes-6-fosfāta izomerāzes spektri un DNS struktūras analīze: garuma polimorfisms restrikcijas fragments (RFLP), ko parasti papildina ar hibridizācijas zondi RG 57, mikrosatelītu atkārtojumu analīze (SSR un InterSSR), amplifikācija ar izlases primeriem (RAPD), restrikcijas fragmentu amplifikācija (AFLP), amplifikācija ar gruntskrāsām, kas ir homoloģiskas mobilo elementu sekvencēm (piemēram, Inter SINE PCR), mitohondriju DNS haplotipu noteikšana.
Īss metožu apraksts celmu salīdzinošai izpētei, ko izmanto darbā ar P. Infestānu
Fenotipisko marķieru iezīmes
"Kartupeļu" sacīkstes
“Kartupeļu” sacīkstes ir bieži pētīts un izmantots marķieris. “Vienkāršo kartupeļu” rasēs ir viens kartupeļu virulences gēns, “sarežģītajos” - vismaz divi. Black et al. (1953), apkopojot visus viņiem pieejamos datus, atklāja, ka fitoftoras rase spēj augus inficēt ar rezistences gēnu / gēniem, kas atbilst P. infestans virulences gēnam / gēniem, un atrada 1., 2., 3. un 4. rasi, kas inficē augus. ar attiecīgi R1, R2, R3 un R4 gēniem, t.i. mijiedarbība starp parazītu un saimnieku notiek saskaņā ar gēna gēna principu. Tālāk Bleks ar Galleglija un Malkolmsona piedalīšanos atklāja rezistences gēnus R5, R6, R7, R8, R9, R10 un R11, kā arī atbilstošās rases (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Ir plašs datu kopums par patogēnu rasu sastāvu no dažādiem reģioniem. Detalizēti neanalizējot šos datus, mēs norādīsim tikai vispārēju tendenci: tur, kur tika izmantotas šķirnes ar jauniem rezistences gēniem vai to kombinācijām, sākumā bija neliela vēlīnās iedegas vājināšanās, bet pēc tam parādījās un tika atlasītas sacīkstes ar atbilstošajiem virulences gēniem un atsākās vēlīnās slimības uzliesmojumi. Specifiskā virulence pret pirmajiem 4 rezistences gēniem (R1-R4) reti tika novērota kolekcijās, kas savāktas pirms šķirņu ieviešanas kultūrā ar šiem gēniem, taču virulentu celmu skaits strauji pieauga, kad patogēns tika parazitēts šķirnēs, kurās ir šie gēni. Savukārt gēni 5–11 bija diezgan izplatīti kolekcijās (Shaw, 1991).
Pētījums par dažādu rasu attiecību veģetācijas periodā, kas veikts 1980. gadu beigās, parādīja, ka slimības attīstības sākumā populācijā dominē kloni ar zemu agresivitāti un 1-2 virulences gēni.
Turklāt, attīstoties vēlīnai pūtītei, sākotnējo klonu koncentrācija samazinās un palielinās "sarežģīto" sacīkšu skaits ar augstu agresivitāti. Pēdējo parādīšanās līdz sezonas beigām sasniedz 100%. Glabājot bumbuļus, samazinās agresivitāte un tiek zaudēti atsevišķi virulences gēni. Klonu aizstāšanas dinamika dažādās šķirnēs var notikt dažādos veidos (Rybakova & Dyakov, 1990). Tomēr mūsu pētījumi 2000. – 2010. Gadā parādīja, ka sarežģīti rasi ir sastopami jau no epifitotikas sākuma celmu vidū, kas izolēti gan no kartupeļiem, gan no tomātiem. Tas, iespējams, ir saistīts ar izmaiņām P. Infestans populācijā Krievijā.
Līdz 1988.-1995. Gadam “superrasu” ar visiem vai gandrīz visiem virulences gēniem sastopamība dažādos reģionos sasniedza 70–100%. Šī situācija tika atzīmēta, piemēram, Baltkrievijā, Ļeņingradas un Maskavas apgabalos, Ziemeļosetijā un Vācijā (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Polityko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
"Tomātu" sacīkstes
Tomātu šķirnēs tika atrasti tikai 2 gēni, kas bija izturīgi pret vēlu puvi - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) un Ph2 (Al-Kherb, 1988). Tāpat kā kartupeļu rases gadījumā, tomātu un P. infestans mijiedarbība notiek pa gēniem. T0 rase inficē šķirnes, kurām nav rezistences gēnu (lielākā daļa rūpnieciski izmantoto šķirņu), T1 rase - Ph1 gēnu (Otava), bet T2 rase - Ph2 gēnu.
Krievijā gandrīz tikai T0 tika atrasts uz kartupeļiem; Sezonas sākumā tomātiem dominēja T0, bet vēlāk to aizstāja T1 skrējiens (Dyakov et al., 1975, 1994). Pēc 2000. gada T1 uz kartupeļiem daudzās populācijās sāka parādīties pašā epifītiķu sākumā. Amerikas Savienotajās Valstīs kartupeļu celmi nebija patogēni tomātiem, kā arī T0, T1 un T2 rases, savukārt T1 un T2 dominēja tomātiem (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Pārošanās veids
Pētījumam ir nepieciešami testa (atsauces) celmi ar zināmiem pārošanās veidiem - A1 un A2. Testa izolātu ar tiem pāros inokulē Petri trauciņos ar auzu agara barotni. Pēc 10 dienu inkubācijas plāksnēm pārbauda celmu kontakta zonā esošo oosporu klātbūtni vai neesamību. Ir 4 varianti: celms pieder pie A1 pārošanās veida, ja tas veido oosporas ar A2 testeri, līdz A2, ja tas veido oosporas ar A1 testeri, līdz A1A2, ja tas veido oosporas ar abiem testētājiem, vai ir sterils (00), ja tas neveido oosporas bez testera (pēdējās divas grupas ir reti).
Lai ātrāk noteiktu pārošanās veidus, tika mēģināts identificēt ar pārošanās veidu saistītos genoma reģionus, lai tos turpmāk izmantotu, lai noteiktu pārošanās veidu ar PCR. Vienu no pirmajiem veiksmīgajiem eksperimentiem šādas vietas noteikšanai veica amerikāņu pētnieki (Judelson et al., 1995). Izmantojot RAPD metodi, viņi spēja identificēt W16 reģionu, kas saistīts ar pārošanās tipu abu sakrustoto izolātu pēcnācējos, un noformēt 24 bp lieluma primeru pāri tā amplifikācijai (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') un W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Pēc PCR produkta ierobežošanas ar restrikcijas enzīmu HaeIII, bija iespējams atdalīt izolātus ar A1 un A2 savienošanas pāriem.
Vēl vienu mēģinājumu iegūt PCR marķierus, lai noteiktu pārošanās veidus, veica Korejas pētnieki (Kim, Lee, 2002). Viņi identificēja konkrētus produktus, izmantojot AFLP metodi. Rezultātā tika izveidoti primeru pāri PHYB-1 (uz priekšu) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') un PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), kas ļāva selektīvi pastiprināt genoma reģionu, kas saistīts ar A2 pārošanās tipu. Pēc tam viņi turpināja šo darbu un izstrādāja primerus 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, uz priekšu) un 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), ļaujot selektīvi pastiprināt Mat-A1 reģionu, kas raksturīgs celmiem ar pārošanās tipu. A1. Pārošanās veidu PCR diagnostikas izmantošana uzrādīja labus rezultātus, pētot P. infestans populācijas Čehijā (Mazakova et al., 2006), Tunisijā (Jmour, Hamada, 2006) un citos reģionos. Mūsu laboratorijā (Mytsa, Elansky, nepublicēts) tika analizēti 34 P. infestans celmi, kas izolēti no slimiem kartupeļu un tomātu orgāniem dažādos Krievijas reģionos (Kostroma, Ryazan, Astrahaņas un Maskavas reģionos). PCR analīzes rezultāti, izmantojot īpašus gruntējumus, kas pārsniedz 90%, sakrīt ar pārošanās veida analīzes rezultātiem ar tradicionālo metodi barības vielu vidē.
1. tabula. Rezistences mainīgums Sib 1 klonā (Elansky et al., 2001)
Paraugu savākšanas vieta | Analizēto izolātu skaits | Jutīgo (S), vāji izturīgo (SR) un izturīgo (R) celmu skaits, gab (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostoka | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Čita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutska | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnojarska | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Jekaterinburgas pilsēta | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sahalīns | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Omskas apgabals | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Metalaksila rezistence kā populācijas marķieris
Astoņdesmito gadu sākumā dažādos reģionos tika konstatēti spēcīgi vēlīnās drudža uzliesmojumi, ko izraisīja metalaksilizturīgie P. infestans celmi. Kartupeļu audzētavas daudzās valstīs ir cietušas ievērojamus zaudējumus (Dowley & O'Sullivan, 1980; Davidse et al., 1981; Derevyagina, 1983). Kopš tā laika daudzās pasaules valstīs pastāvīgi tiek novērots fenilamīdu rezistentu celmu sastopamība P. infestans populācijās. Papildus praktiskam fenilamīdu saturošu zāļu lietošanas perspektīvu novērtējumam, aizsargpasākumu sistēmas izveidei un epifitoties paredzēšanai, rezistence pret šīm zālēm ir kļuvusi par vienu no marķiera pazīmēm, ko plaši izmanto šī patogēna populāciju salīdzinošai analīzei. Tomēr rezistences pret metalaksilu izmantošana salīdzinošos populācijas pētījumos jāveic, ņemot vērā faktu, ka: 1991 - rezistences ģenētiskais pamats vēl nav precīzi noteikts, 1 - rezistence pret metalaksilu ir selektīvi atkarīga iezīme, kas var mainīties atkarībā no fenilamīdu lietošanas, 2 - atšķirīga jutības pakāpe pret metalaksila celmiem vienā klonālā līnijā (3. tabula).
Izozīmu spektri
Izocīma marķieri parasti ir neatkarīgi no ārējiem apstākļiem, uzrāda Mendeli mantojumu un ir kodominanti, ļaujot atšķirt homo- un heterozigotas. Olbaltumvielu izmantošana kā gēnu marķierus ļauj identificēt gan lielas ģenētiskā materiāla reorganizācijas, ieskaitot hromosomu un genomu mutācijas, gan atsevišķu aminoskābju aizvietojumus.
Olbaltumvielu elektroforētiskie pētījumi parādīja, ka lielākā daļa enzīmu organismos pastāv vairāku frakciju veidā, kas atšķiras ar elektroforētisko mobilitāti. Šīs frakcijas ir rezultāts dažādu enzīmu dažādu kodējumu (izozīmu vai izozīmu) vai viena un tā paša lokusa dažādu alēļu (alozīmu vai aloenzīmu) kodēšanai. Tas ir, izozīmi ir viena fermenta dažādas formas. Dažādām formām ir vienāda katalītiskā aktivitāte, taču tās nedaudz atšķiras pēc atsevišķu aminoskābju aizvietojumiem peptīdā un atbildīgajā. Šādas atšķirības tiek atklātas elektroforēzes laikā.
Pētot P. infestans celmus, tiek izmantoti divu olbaltumvielu - peptidāzes un glikozes-6-fosfāta izomerāzes - izoenzīmu spektri (Krievijas populācijās šis ferments ir monomorfs, tāpēc tā izpētes metodes šajā darbā nav norādītas). Lai tos elektriskajā laukā sadalītu izozīmos, olbaltumvielu preparātus, kas izolēti no pētītajiem organismiem, uzklāj uz gēla plāksnes, kas ievietota elektriskajā laukā. Atsevišķu olbaltumvielu difūzijas ātrums gēlā ir atkarīgs no lādiņa un molekulmasas, tāpēc elektriskajā laukā olbaltumvielu maisījums tiek sadalīts atsevišķās frakcijās, kuras var vizualizēt, izmantojot īpašas krāsvielas.
Peptidāzes izoenzīmu izpēti veic ar celulozes-acetāta, cietes vai poliakrilamīda gēliem. Ērtākā ir Helena Laboratories Inc. ražotās celulozes acetāta želeju izmantošanas metode. Tas neprasa lielu daudzumu testa materiālu, tas ļauj iegūt gēla kontrastējošās joslas pēc elektroforēzes abiem enzīmu lokusiem, tā ieviešana neprasa lielas laika un materiāla izmaksas (2. attēls).
Neliels micēlija gabals tiek pārnests 1,5 ml mikrocaurulītē, tam pievieno 1-2 pilienus destilēta ūdens. Pēc tam paraugs tiek homogenizēts (piemēram, ar elektrisko urbjmašīnu ar mikrodaļiņai piemērotu plastmasas stiprinājumu) un 25 sekundes nogulsnēts centrifūgā ar ātrumu 13000 apgr./min. 8 μl no katra mikrokamba. supernatantu pārnes uz aplikatora plāksnes.
Celulozes acetāta gels tiek noņemts no bufera trauka, notraipīts starp divām filtrpapīra loksnēm un novietots ar darba slāni uz augšu uz aplikatora plastmasas pamatnes. Šķīdumu no plāksnes ar aplikatoru pārnes uz želejas 2-4 reizes. Gelu pārnes elektroforēzes kamerā,
2. tabula. Šķīduma sastāvs, ko peptidāzes izoenzīmu analīzē izmanto celulozes acetāta gēla krāsošanai, uz želejas malas tiek uzlikts krāsas piliens (bromfenola zils).
TRIS HCl, 0,05 M, Ph 8,0, 2 ml
Peroksidāze, 1000 V / ml 5 pilieni
o-dianizidīns, 4 mg / ml 8 pilieni
MgCl2, 20 mg / ml 2 pilieni
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 pilieni
L-aminoskābju oksidāze, 20 vienības / ml 2 pilieni
Elektroforēzi veic 20 minūtes. pēc elektroforēzes gēlu pārnes uz krāsošanas galda un iekrāso ar īpašu krāsošanas šķīdumu (200. tabula). 2 ml 10% DIFCO agara iepriekš izkausē mikroviļņu krāsnī, atdzesē līdz 1,6 ° C, pēc tam 60 ml agara sajauc ar krāsas maisījumu un ielej uz želejas. Svītras parādās 2-15 minūšu laikā. L-aminoskābju oksidāzes reaģentu pievieno tieši pirms šķīduma sajaukšanas ar izkausētu agaru.
Krievijas populācijās Pep 1 lokusu attēlo genotipi 100/100 un 92/100. Homozigota 92/92 ir ārkārtīgi reti sastopama (apmēram 0,1%). Locus Rehr 2 attēlo trīs genotipi 100/100, 100/112 un 112/112, un visi 3 varianti ir diezgan izplatīti (Elanky and Smirnov, 2003, 2. attēls).
Genoma izpēte
Ierobežojošā fragmenta garuma polimorfisms ar sekojošu hibridizāciju (RFLP-RG 57)
Kopējo DNS apstrādā ar EcoR1 restrikcijas enzīmu, DNS fragmentus atdala ar elektroforēzi agarozes gēlā. Kodola DNS ir ļoti liela, un tai ir daudz atkārtotu sekvenču, tāpēc ir grūti tieši analizēt daudzos fragmentus, kas iegūti, iedarbojoties ar restrikcijas enzīmiem. Tāpēc gēlā atdalītie DNS fragmenti tiek pārnesti uz īpašu membrānu un izmantoti hibridizācijai ar RG 57 zondi, kas ietver nukleotīdus, kas apzīmēti ar radioaktīvām vai fluorescējošām etiķetēm. Šī zonde hibridizējas ar atkārtotām genomiskām sekvencēm (Goodwin et al., 1992, Forbes et al., 1998). Pēc hibridizācijas rezultātu vizualizācijas uz gaismas vai radioaktīva materiāla tiek iegūts daudzvietīgs hibridizācijas profils (pirkstu nospiedumi), ko attēlo 25-29 fragmenti (Forbes et al., 1998). Neveiksmīgām (klonālām) pēcnācējām būs vienādi profili. Joslu atrašanās vieta elektroforetogrammā tiek izmantota, lai spriestu par salīdzināto organismu līdzībām un atšķirībām.
Mitohondriju DNS haplotipi
Lielākajā daļā eikariotu šūnu mtDNS ir divkāršu cirkulāras DNS molekulas formā, kas atšķirībā no eikariotu šūnu kodola hromosomām atkārtojas daļēji konservatīvi un nav saistīta ar olbaltumvielu molekulām.
Tika secēts P. infestans mitohondriju genoms, un virkne darbu tika veltīti restrikcijas fragmentu garumu analīzei (Carter et al, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Pēc tam, kad Grifits un Šovs (1998) izstrādāja vienkāršu un ātru metodi mtDNS haplotipu noteikšanai, šis marķieris kļuva par vienu no populārākajiem P. Infestāna pētījumos. F2-R2 (4. tabula) un to turpmākā ierobežošana ar restrikcijas enzīmiem MspI (4. fragments) un EcoR3 (1. fragments). Metode ļauj identificēt 1 haplotipus: Ia, IIa, Ib, IIb. II tips no I tipa atšķiras ar 2 bp ievietojuma klātbūtni un atšķirīgu restrikcijas vietu izvietojumu P4 un P1881 reģionos (2. attēls).
Kopš 1996. gada starp Krievijas teritorijā savāktajiem celmiem tika atzīmēti tikai Ia un IIa haplotipi (Elansky et al., 2001, 2015). Tos var identificēt pēc ierobežošanas produktu atdalīšanas ar F2-R2 grunti elektriskajā laukā (4., 5. att.). Celmu un populāciju salīdzinošajā analīzē tiek izmantoti mtDNS veidi. Vairākos darbos mitohondriju DNS tipi tika izmantoti, lai izolētu klonālās līnijas un pasportizētu P. infestans izolātus (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Izmantojot PCR-RFLP metodi, tika secināts, ka mtDNS ir neviendabīga tajā pašā P. infestans celmā (Elansky and Milyutina, 2007). Amplifikācijas apstākļi: 1x (500 sek. 94 ° C), 40x (30 sek. 90 ° C, 30 sekundes 52 ° C, 90 sekundes 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Reakcijas maisījums: (20 μl): 0,2 U Taq DNS polimerāze, 1x 2,5 mM MgCl2-Taq buferšķīdums, 0,2 mM katrs dNTP, 30 pM grunts un 5 ng analizētās DNS, dejonizēts ūdens - līdz 20 μl.
PCR produkta ierobežošana tiek veikta 4-6 stundas 37 ° C temperatūrā. Ierobežojošais maisījums (20 μl): 10x MspI (2 μl), 10x restrikcijas buferis (2 μl), dejonizēts ūdens (6 μl), PCR produkts (10 μl).
3. tabula. Primeri, ko izmanto mtDNS polimorfo reģionu amplifikācijai
Lokuss | Primer | Grunts garums un izvietojums | PCR produkta garums | Restrictase |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21. gads; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22. gads; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22. gads; 9329-9350 | 964 | Ecori |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22. gads; 10292-10271 |
Nejauša primer amplifikācija (RAPD)
Veicot RAPD, tiek izmantots viens grunts (dažreiz vairāki grunti vienlaikus) ar patvaļīgu nukleotīdu secību, parasti 10 nukleotīdu garumā, ar lielu GC nukleotīdu saturu (no 50%) un zemu atlaidināšanas temperatūru (apmēram 35 ° C). Šādi gruntskrēsli "piezemējas" uz daudzām papildu vietām genomā. Pēc amplifikācijas tiek iegūts liels skaits amplikonu. To skaits ir atkarīgs no izmantotā (-ajiem) grunts (-iem) un reakcijas apstākļiem (MgCl2 koncentrācija un atlaidināšanas temperatūra).
Amplikonu vizualizāciju veic, destilējot poliakrilamīdā vai agarozes želejā. Veicot RAPD analīzi, rūpīgi jāuzrauga analizējamā materiāla tīrība, jo piesārņojums ar citiem dzīviem objektiem var izraisīt ievērojamu artefaktu skaita pieaugumu, kuru tīra materiāla analīzē ir diezgan daudz (Perez et al, 1998). Šīs metodes izmantošana P. infestans genoma izpētē ir atspoguļota daudzos darbos (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). Reakcijas apstākļu un gruntskrāsu izvēle (tika pētīts 51 10 nukleotīdu grunts) ir sniegta Abu-El Samen et al., (2003) rakstā.
Mikrosatelīta atkārtota analīze (SSR)
Mikrosatelītu atkārtošanās (vienkāršas secības atkārtošanās, SSR) ir tandēmi atkārtotas īsas 1-3 (dažreiz līdz 6) nukleotīdu sekvences, kas atrodas visu eikariotu kodola genomos. Secīgu atkārtojumu skaits var svārstīties no 10 līdz 100. Mikrosatelītu loki sastopami ar diezgan augstu frekvenci un ir vairāk vai mazāk vienmērīgi sadalīti visā genomā (Lagercrantz et al., 1993). Mikrosatelītu secību polimorfisms ir saistīts ar atšķirībām pamata motīva atkārtojumu skaitā. Mikrosatelītu marķieri ir kodominanti, kas ļauj tos izmantot, lai analizētu populācijas struktūru, noteiktu radniecību, genotipa migrācijas ceļus utt. Starp citām šo marķieru priekšrocībām jāatzīmē to augstais polimorfisms, laba reproducējamība, neitralitāte un spēja veikt automātisku analīzi un novērtēšanu. Mikrosatelītu atkārtošanās polimorfisma analīzi veic ar PCR amplifikāciju, izmantojot primerus, kas papildina unikālas mikrosatelītu lokusus papildinošas secības. Sākumā analīzi veica, atdalot reakcijas produktus uz poliakrilamīda gela. Vēlāk uzņēmuma Applied Biosystems darbinieki ierosināja izmantot fluorescējoši marķētus primerus ar reakcijas produktu noteikšanu, izmantojot automātisko lāzera detektoru (Diehl et al., 1990), un pēc tam standarta automātiskos DNS sekvencerus (Ziegle et al., 1992). Gruntskrāsu marķēšana ar dažādām fluorescējošām krāsvielām ļauj vienlaikus analizēt vairākus marķierus vienā joslā un attiecīgi ievērojami palielināt metodes produktivitāti un palielināt analīzes precizitāti.
Pirmās publikācijas, kas veltītas SSR analīzes izmantošanai P. infestans pētījumam, parādījās 2000. gadu sākumā. (Knapova, Gisi, 2002). Ne visi autoru piedāvātie marķieri parādīja pietiekamu polimorfisma pakāpi, tomēr divi no tiem (4B un G11) tika iekļauti 12 SSR marķieru komplektā, ko piedāvāja Lees et al. (2006) un pēc tam tos pieņēma Eucablight pētījumu tīkls (www.eucablight .org) kā standarts P. infestans. Dažus gadus vēlāk tika publicēts pētījums par P. infestans DNS multiplās analīzes sistēmas izveidi, pamatojoties uz astoņiem SSR marķieriem (Li et al., 2010). Visbeidzot, novērtējot visus iepriekš piedāvātos marķierus un izvēloties informatīvākos no tiem, kā arī optimizējot primerus, fluorescējošas etiķetes un amplifikācijas apstākļus, tā pati autoru grupa iesniedza vienpakāpju multipleksās analīzes sistēmu, ieskaitot 12 marķierus (4. tabula; Li et al. , 2013a). Šajā sistēmā izmantotie grunti tika atlasīti un marķēti ar vienu no četriem fluorescējošiem marķieriem (FAM, VIC, NED, PET) tā, lai grunts ar to pašu marķējumu alēļu izmēru diapazoni nepārklātos.
Autori veica PTC200 pastiprinātāja (MJ Research, ASV) analīzi, izmantojot QIAGEN multipleksa PCR komplektus vai QIAGEN Typeit Microsatellite PCR komplektus. Reakcijas maisījuma tilpums bija 12.5 μL. Amplifikācijas apstākļi bija šādi: QIAGEN multipleksā PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C (20 min); QIAGEN Type-it Microsatellite PCR): 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 s), 58 ° C (90 sek), 72 ° C (20 sek), 60 ° C (30 minūtes).
PCR produktu atdalīšana un vizualizācija tika veikta, izmantojot ABI3730 automātisko kapilāru DNS analizatoru (Applied Biosystems).
4. tabula. P. Infestans genotipēšanai izmantoto 12 standarta SSR marķieru raksturojums (Li et al., 2013a)
Nosaukums | Alēļu skaits | Izmēru diapazons alēles (bp) | Gruntskrāsas |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Ft02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTCAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
Ft04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTACCGATGG R: GTTTCAGGGGCTGTTTCGAC |
Ft70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCAAAGATTTATTCCG |
Ft63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Analīzes rezultātu vizualizācijas piemērs ir parādīts attēlā. 6. Rezultāti tika analizēti, izmantojot GeneMapper 3.7 programmatūru, salīdzinot iegūtos datus ar zināmo izolātu datiem. Lai atvieglotu analīzes rezultātu interpretāciju, katrā pētījumā jāiekļauj 1-2 atsauces izolāti ar zināmu genotipu.
Piedāvātā pētījuma metode tika pārbaudīta uz ievērojama skaita lauka paraugu, pēc tam autori standartizēja protokolus starp divu organizāciju - Džeimsa Hatona institūta (Lielbritānija) un Vāgeningena universitātes un pētniecības (Nīderlande) laboratorijām -, kā arī iespēju vienkāršotām kārtām izmantot standarta BTN kartes P. infestans DNS paraugu savākšana un nosūtīšana ļāva runāt par šīs attīstības komerciālas izmantošanas iespējām. Turklāt ātra un precīza P. infestans izolātu genotipēšanas metode, izmantojot multiplās SSR analīzi, ļāva veikt standartizētus šī patogēna populāciju pētījumus globālā mērogā, kā arī izveidot pasaules datubāzi par vēlo puvi Eucablight projekta ietvaros (www.eucablight.org), ieskaitot , ieskaitot mikrosatelītu analīzes rezultātus, ļāva izsekot jaunu genotipu parādīšanos un izplatību visā pasaulē.
Pastiprināta restrikcijas fragmenta garuma polimorfisms (AFLP). AFLP (amplificētā fragmenta garuma polimorfisms) ir tehnoloģija nejaušu molekulāro marķieru ģenerēšanai, izmantojot specifiskus primerus. AFLP DNS apstrādā ar divu restrikcijas enzīmu kombināciju. Specifiskie adapteri tiek piesaistīti restrikcijas fragmentu lipīgajiem galiem.
Pēc tam šos fragmentus pastiprina, izmantojot primerus, kas ir komplementāri adaptera secībai un restrikcijas vietai, un to 3 'galos papildus saturot vienu vai vairākas nejaušas bāzes. Iegūto fragmentu kopums ir atkarīgs no restrikcijas enzīmiem un nejauši izvēlētiem nukleotīdiem primeru 3'-galos (Vos et al., 1995). AFLP - genotipēšana tiek izmantota, lai ātri izpētītu dažādu organismu ģenētiskās variācijas.
Metodes sīks apraksts ir sniegts Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et al., 1999 darbos. Ķīnas pētnieki ir veikuši daudz darba, salīdzinot AFLP un SSR metožu izšķirtspēju. Tika pētīti 48 P. infestans izolātu fenotipiskie un genotipiskie raksturlielumi, kas savākti no pieciem Ziemeļķīnas reģioniem. AFLP spektros tika atklāti astoņi dažādi DNS genotipi, atšķirībā no SSR genotipiem, kuriem nekāda daudzveidība netika atrasta (Guo et al., 2008).
Amplifikācija ar primeriem, kas ir homologi mobilo elementu sekvencēm
Marķieri, kas iegūti no retrotranspozonu sekvencēm, ir ļoti ērti ģenētiskai kartēšanai, ģenētiskās daudzveidības un evolūcijas procesu izpētei (Schulman, 2006). Ja grunti tiek izgatavoti, lai papildinātu noteiktu mobilo elementu stabilās sekvences, ir iespējams pastiprināt starp tiem esošos genoma reģionus. Pētījumos par vēlīnās iedeguma izraisītāju veiksmīgi tika izmantota genoma daļu pastiprināšanas metode, izmantojot primeru, kas papildina retropazona SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) kodola secību (Lavrova un Elansky, 2003). Izmantojot šo metodi, tika atklātas atšķirības pat viena izolāta bezdzimuma pēcnācējos. Šajā sakarā tika secināts, ka starp SINE - PCR metode ir ļoti specifiska un SINE elementu kustības ātrums Phytophthora genomā ir augsts.
P. infestans genomā ir identificētas 12 īsu retrotranspozonu (SINE) ģimenes; tika pētīts īsu retrotranspozonu sugu sadalījums, identificēti elementi (SINE), kas atrodami tikai P. infestans genomā (Lavrova, 2004).
Celmu salīdzinošā pētījuma metožu pielietošanas iezīmes populācijas pētījumos
Plānojot pētījumu, skaidri jāsaprot tā mērķi un jāizmanto atbilstošās metodes. Tādējādi dažas metodes ļauj radīt lielu skaitu neatkarīgu marķieru zīmju, bet tajā pašā laikā tām ir zema reproducējamība un tās ir ļoti atkarīgas no izmantotajiem reaģentiem, reakcijas apstākļiem un testa materiāla piesārņojuma. Tādēļ katrā celma grupas pētījumā ir jāizmanto vairāki standarta (atsauces) izolāti, taču pat šajā gadījumā vairāku eksperimentu rezultātus ir ļoti grūti apvienot.
Šajā metožu grupā ietilpst RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Pēc amplifikācijas tiek iegūts liels skaits dažāda lieluma DNS fragmentu. Šādus paņēmienus ieteicams izmantot, ja nepieciešams noteikt atšķirības starp cieši saistītiem celmiem (vecāku pēcnācējiem, savvaļas tipa mutantiem utt.) Vai gadījumos, kad nepieciešama detalizēta neliela parauga analīze. Tādējādi AFLP metodi plaši izmanto P. infestans ģenētiskajā kartēšanā (van der Lee et al., 1997) un intrapopulācijas pētījumos (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). Šādas metodes nav praktiski izmantot, veidojot celmu datubāzes, jo veicot analīzes dažādās laboratorijās, ir gandrīz neiespējami vienot rezultātu uzskaiti.
Neskatoties uz šķietamo izpildes vienkāršību un ātrumu (DNS izolēšana bez labas attīrīšanas, amplifikācijas, rezultātu vizualizācijas), šai metožu grupai rezultātu dokumentēšanai nepieciešama īpaša metode: destilēšana poliakrilamīda želejā ar marķētiem (radioaktīvi vai luminiscējoši) gruntskrāsiem un turpmāka gaismas vai radioaktīva materiāla iedarbība. Parastā etīdija bromīda agarozes gēla attēlveidošana šīm metodēm parasti nav piemērota, jo var saplūst liels skaits dažāda lieluma DNS fragmentu.
Citas metodes, gluži pretēji, ļauj radīt nelielu skaitu pazīmju ar ļoti augstu reproducējamību. Šajā grupā ietilpst mitohondriju DNS haplotipu pētījumi (Krievijā tiek atzīmēti tikai divi Ia un IIa haplotipi), pārošanās veids (lielākā daļa izolātu ir sadalīti 2 tipos: A1 un A2, reti tiek atrasti pašauglīgi SF) un peptidāzes izozīmu spektri (divi lokusi Pep1 un Pep2 , kas sastāv no diviem izozīmiem katrā) un glikozes-6-fosfāta izomerāzes (Krievijā šī īpašība nav mainīga, lai gan citās pasaules valstīs ir ievērojams polimorfisms). Šīs funkcijas ieteicams izmantot, analizējot kolekcijas, apkopojot reģionālās un globālās datubāzes. Mitohondriju DNS izozīmu un haplotipu analīzes gadījumā vispār var iztikt bez standarta celmiem, savukārt pārošanās tipu analīzē nepieciešami divi testa izolāti ar zināmiem pārošanās veidiem.
Reakcijas apstākļi un reaģenti var ietekmēt tikai produkta kontrastu uz elektroforetogrammu; artefaktu izpausme šāda veida pētījumos ir maz ticama.
Pašlaik lielāko daļu populāciju Krievijas Eiropas daļā pārstāv abu pārošanās veidu celmi (6. tabula), starp tiem ir izolāti ar mitohondriju DNS Ia un IIa tipiem (citi pasaulē sastopamie mtDNS veidi pēc 1993. gada Krievijā nav atrasti). Peptidāzes izozīmu spektrus Pep1 lokusā attēlo divi genotipi (100/100, 92/92 un heterozigota 92/100, un 92/92 genotips ir ārkārtīgi reti (<0,3%)) un divi genotipi Pep 2 lokusā (100/100 , 112/112 un heterozigota 100/112, ar genotipu 112/112 sastopami retāk nekā 100/100, bet arī diezgan bieži).
Pēc 6. gada (kloniskās līnijas US-1993 izzušana) glikozes-1-fosfāta izomerāzes izozīmu spektrā nebija atšķirību; visiem pētītajiem izolātiem bija 100/100 genotips (Elansky un Smirnov, 2002).
Trešā metožu grupa ļauj iegūt pietiekamu neatkarīgu marķiera pazīmju grupu ar augstu reproducējamību. Šodien šajā grupā ietilpst RFLP-RG57 zonde, kas ražo 25-29 dažāda lieluma DNS fragmentus. RFLP-RG57 var izmantot gan analizējot paraugus, gan apkopojot datu bāzes. Tomēr šī metode ir daudz dārgāka nekā iepriekšējās, tā ir laikietilpīga un prasa pietiekami lielu daudzumu ļoti attīrītas DNS. Tāpēc pētnieks ir spiests ierobežot pārbaudītā materiāla apjomu.
RFLP-RG57 attīstība pagājušā gadsimta 90. gadu sākumā ievērojami pastiprināja populācijas pētījumus par vēlīnās iedeguma izraisītāju. Tas kļuva par pamatu metodei, kuras pamatā bija "Klonālo līniju" atlase un analīze (skat. Zemāk). Kopā ar RFLP-RG57 klonisko līniju identificēšanai tiek izmantots pārošanās veids, DNS pirkstu nospiedumu noņemšana (RFLP-RG57 metode), peptidāzes un glikozes-6-fosfāta izomerāzes izoenzīmu spektri un mitohondriju DNS tips. Pateicoties viņam, tas tika parādīts al., 1994), veco populāciju aizstāšana ar jaunām (Drenth et al, 1993, Sujkowski et al, 1994, Goodwin et al, 1995a), kā arī tika identificētas daudzās pasaules valstīs dominējošās klonālās līnijas. Pētījumi par krievu celmiem, izmantojot šo metodi, parādīja augstu Eiropas daļas celmu genotipisko polimorfismu un Krievijas Āzijas un Tālo Austrumu daļu populāciju monomorfismu (Elansky et al, 2001). Un tagad šī metode joprojām ir galvenā P. infestans populācijas pētījumos. Tomēr tā plašo izplatību kavē diezgan augstās izmaksas un darbietilpība izpildē.
Vēl viena daudzsološa tehnika, ko reti izmanto P. infestans pētījumos, ir mikrosatelītu atkārtojuma (SSR) analīze. Pašlaik šo metodi plaši izmanto, lai izolētu klonālās līnijas. Celmu analīzē plaši izmantoja (un turpina lietot) tādas fenotipiskas marķiera pazīmes kā virulences gēnu klātbūtne kartupeļu šķirnēm (Avdey, 1995, Ivanyuk et al., 2002, Ulanova et al., 2003) un tomātiem. Līdz šim kartupeļu šķirņu virulences gēni ir zaudējuši savu vērtību kā populācijas pētījumu marķiera pazīmes, jo lielākajā daļā izolātu ir parādījies maksimālais (vai tuvu tam) virulences gēnu skaits. Tajā pašā laikā T1 virulences gēns tomātu šķirnēm, kurām ir atbilstošais Ph1 gēns, joprojām tiek veiksmīgi izmantots kā marķiera iezīme (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
Daudzos darbos izturību pret fungicīdiem izmanto kā marķiera iezīmi. Šo iezīmi nav vēlams izmantot populācijas pētījumos, jo pēc metalaksilu (vai mefenoksamu) saturošu fungicīdu izmantošanas laukā diezgan viegli parādās rezistences mutācijas klonu līnijās. Piemēram, Sib1 klonālās līnijas ietvaros tika uzrādītas būtiskas pretestības līmeņa atšķirības (Elansky et al., 2001).
Tādējādi pārošanās tips, peptidāzes izozīmu spektrs, mitohondriju DNS tips, RFLP-RG57, SSR ir vēlamie marķieri datu banku veidošanai un celmu marķēšanai kolekcijās. Lai salīdzinātu ierobežotos paraugus, ja ir nepieciešams izmantot maksimālo marķiera pazīmju skaitu, varat izmantot AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (5. tabula). Tomēr jāatceras, ka šīs metodes ir slikti reproducējamas, un katrā atsevišķā eksperimentā (amplifikācijas elektroforēzes ciklā) jāizmanto vairāki standartizolāti.
5. tabula. Celmu dažādu pētījumu metožu salīdzinājums P. Infestāns
kritērijs | TC | Isofer policisti | MtDNS | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | Rev |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Informācijas apjoms | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Reproducējamība | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Artefaktu iespējamība | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Izmaksāt | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Darba intensitāte | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Analīzes ātrums ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Piezīme: H - zems, C - vidējs, B - augsts; НС * - darbaspēka intensitāte ir zema, lietojot agarozes želeju vai automātisko
vidējs genotipers - destilējot poliakrilamīda želejā ar marķētiem gruntskrāsām,
** - neskaitot laiku, kas pavadīts micēlija audzēšanai DNS izolēšanai.
Iedzīvotāju struktūra
Klonālās līnijas
Tā kā nav rekombinācijas vai tās nenozīmīgais ieguldījums populācijas struktūrā, populāciju veido noteikts skaits klonu, starp kuriem ģenētiskās apmaiņas notiek ārkārtīgi reti.
Šādās populācijās ir informatīvāk pētīt nevis atsevišķu gēnu biežumu, bet gan tādu genotipu biežumu, kuriem ir kopēja izcelsme (klonālās vai klonālās līnijas) un kas atšķiras tikai pēc punktu mutācijām. Kopš RFLP-RG57 metodes parādīšanās pagājušā gadsimta 90. gadu sākumā ir ievērojami paātrinājušies vēlīnā purva patogēna populācijas pētījumi un klonu līniju analīze. Kopā ar RFLP-RG57 klonisko līniju identificēšanai tiek izmantots pārošanās veids, peptidāzes un glikozes-6-fosfāta izomerāzes izoenzīmu spektri un mitohondriju DNS tips. Visizplatītāko klonālo līniju raksturojums parādīts 6. tabulā.
ASV-1 klons visur dominēja populācijās līdz 80. gadu beigām, pēc tam to sāka aizstāt ar citiem kloniem un pazuda no Eiropas un Ziemeļamerikas. Tagad tas ir sastopams Tālajos Austrumos (Filipīnas, Taivāna, Ķīna, Japāna, Koreja, Koh et al., 1994, Mosa et al, 1993), Āfrikā (Uganda, Kenija, Ruanda, Goodwin et al, 1994, Vega-Sanchez et al., 2000; Ochwo et al., 2002) un Dienvidamerikā (Ekvadora, Brazīlija, Peru, Forbes et al., 1997, Goodwin et al., 1994). Tikai Austrālijā nav identificēti celmi, kas pieder pie līnijas US-1. Acīmredzot P. infestans izolāti ieradās Austrālijā ar citu migrācijas vilni (Goodwin, 1997).
ASV-6 klons 70. gadu beigās migrēja no Meksikas ziemeļiem uz Kaliforniju un pēc 32 gadiem bez slimībām kartupeļos un tomātos izraisīja epidēmiju. Augstas agresivitātes dēļ tas izspieda ASV-1 klonu un sāka dominēt ASV rietumu krastā (Goodwin et al., 1995a).
Genotipi US-7 un US-8 tika atklāti ASV 1992. gadā, un jau 1994. gadā tie tika plaši izplatīti Amerikas Savienotajās Valstīs un Kanādā. Vienas lauka sezonas laikā klons US-8 spēj gandrīz pilnībā izspiest US-1 klonu kartupeļu parauglaukumos, kas sākotnēji inficēti ar abiem kloniem vienādā koncentrācijā (Miller and Johnson, 2000).
Kloni BC-1 līdz BC-4 ir identificēti Britu Kolumbijā nelielā skaitā izolātu no Goodwin et al., 1995b). ASV-11 klons plaši izplatījās Amerikas Savienotajās Valstīs un aizstāja ASV-1 Taivānā. Kloni JP-1 un EC-1 kopā ar klonu US-1 ir izplatīti attiecīgi Japānā un Ekvadorā (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 ir klons, kas Krievijā dominēja plašā teritorijā no Maskavas apgabala līdz Sahalīnai. Maskavas apgabalā tas tika atklāts 1993. gadā, un dažas lauka populācijas galvenokārt sastāvēja no šīs klonālās līnijas celmiem, kas ir ļoti izturīgi pret metalaksilu. Pēc 1993. gada šī klona izplatība ievērojami samazinājās. Ārpus Urāliem 1997.-1998. Gadā SIB-1 tika atrasts visur, izņemot Habarovskas teritoriju (tur ir plaši izplatīts klons SIB-2). Klonu telpiskā nošķiršana ar dažāda veida pārošanos izslēdz seksuālo procesu Sibīrijā un Tālajos Austrumos. Maskavas apgabalā, atšķirībā no Sibīrijas, iedzīvotājus pārstāv daudzi kloni; gandrīz katram izolātam ir unikāls multilokusa genotips (Elansky et al., 2001, 2015). Šo daudzveidību nevar izskaidrot tikai ar sēnīšu celmu importu no dažādām pasaules daļām ar importētu sēklu materiālu. Tā kā populācijā notiek abi pārošanās veidi, iespējams, ka tā daudzveidība ir saistīta arī ar rekombināciju. Tādējādi Britu Kolumbijā tiek pieņemts, ka BC-2, BC-3 un BC-4 genotipi parādās BC-1 un US-6 klonu hibridizācijas dēļ (Goodwin et al., 1995b). Iespējams, ka hibrīdie celmi ir sastopami Maskavas populācijās. Piemēram, PE-lokusam heterozigoti celmi MO-4, MO-8 un MO-11 var būt hibrīdi starp MO-12, MO-21, MO-22 celmiem, kuriem ir A2 pārošanās tips, un homozigoti vienam PEP lokusa un celma celmam. MO-8, kam ir A1 pārošanās tips un homozigota attiecībā pret citu lokusa alēli. Un, ja tas tā ir, un mūsdienu P. infestans populācijās ir tendence uz dzimumprocesa lomas palielināšanos, tad multilokusa klonu analīzes informācijas vērtība samazināsies (Elansky et al., 2001, 2015).
Klonālo līniju variācija
Līdz 90. gadsimta 20. gadiem klonālā līnija US-1 bija plaši izplatīta pasaulē. Lielāko daļu lauka un reģionālo populāciju veidoja tikai celmi ar US-1 genotipu. Tomēr tika novērotas arī atšķirības starp izolātiem, ko, visticamāk, izraisīja mutācijas process. Mutācijas notika gan kodola, gan mitohondriju DNS, un tās cita starpā ietekmēja rezistences līmeni pret fenilamīda zālēm un virulences gēnu skaitu. Līnijas, kas atšķiras no sākotnējiem genotipiem pēc mutācijām, tiek norādītas ar papildu numuriem aiz punkta, kas seko oriģinālā genotipa nosaukumam (piemēram, US-1.1 klonālās līnijas mutācijas līnija US-1). Pirkstu nospiedumu DNS līnijas US-1.5 un US-1.6 satur dažāda lieluma piederumu līnijas (Goodwin et al., 1995a, 1995b); klonālā līnija US-6.3 atšķiras arī no US-6 ar vienu piederumu līniju (Goodwin, 1997, 7. tabula).
Pētot mitohondriju DNS, tika atklāts, ka klonālajā līnijā US-1 ir atrodams tikai mitohondriju DNS 1.b tips (Carter et al., 1990). Tomēr, pētot šīs Peru un Filipīnu klonālās līnijas celmus, tika atrasti izolāti, kuru mitohondriju DNS tipi no 1b atšķīrās ar ievietojumu un delēciju klātbūtni (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
6. tabula. Dažu P. infestans klonālo līniju multilokusa genotipi
Nosaukums | Pārošanās veids | Izozīmi | DNS pirkstu nospiedumi | MtDNS tips | |
GPI | PEP | ||||
ASV 1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011 + 24 | Ib |
ASV 2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011 + 24 | Sākot no |
ASV 3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011 + 24 | Sākot no |
ASV 4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011 + 24 | Sākot no |
ASV 5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011 + 24 | Sākot no |
ASV 6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011 + 24 | IIb |
ASV 7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011 + 24 | Ia |
ASV 8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011 + 24 | Ia |
ASV 9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | Sākot no |
ASV 10 | A2 | 111/122 | 100/100 | Sākot no | Sākot no |
ASV 11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011 + 24 | IIb |
ASV 12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | Sākot no |
ASV 14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011 + 24 | Sākot no |
ASV 15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
ASV 16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011 + 24 | Sākot no |
ASV 17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011 + 24 | Sākot no |
ASV 18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
ASV 19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011 + 24 | Ia |
EK-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011 + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011 + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011 + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011 + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011 + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011 + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011 + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011 + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011 + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011 + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011 + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011 + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
Piezīme: * - nav datu.
7. tabula. Multilokusa genotipi un to mutantu līnijas
Nosaukums | Pārošanās veids | | DNS pirkstu nospiedumi (RG57) | piezīmes | |
GPI | PEP-1 | ||||
ASV 1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Sākotnējais 1. genotips |
ASV 1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutācija PEP |
ASV 1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutācija RG57 |
ASV 1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutācija RG57 |
ASV 1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutācija RG57 un PEP |
ASV 1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutācija RG57 |
ASV 6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Sākotnējais 2. genotips |
ASV 6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutācija PEP |
ASV 6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutācija RG57 |
ASV 6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutācija RG57 |
ASV 6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutācija RG57 un PEP |
ASV 6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutācija RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Sākotnējais 3. genotips |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutācija RG57 |
Izozīmu spektros ir arī izmaiņas. Parasti tos izraisa sākotnēji šim fermentam heterozigots organisms sadalās homozigotos organismos. 1993. gadā uz tomātu augļiem mēs identificējām celmu ar raksturīgām pazīmēm, kas raksturīgas US-1: RG57 pirkstu nospiedumu noņemšana, mitohondriju DNS tips un glikozes-86-fosfati-izomerāzes 100/6 genotips, bet pirmajam peptidāzes lokusam tas bija homozigots (100/100). šai kloniskajai līnijai raksturīga 92/100 heterozigota. Mēs nosaucām šī celma genotipu MO-17 (6. tabula). Mutantu līnijas US-1.1 un US-1.4 atšķiras arī no US-1 ar mutācijām pirmajā peptidāzes lokusā (7. tabula).
Mutācijas, kas noved pie kartupeļu un tomātu šķirņu virulences gēnu skaita izmaiņām, ir diezgan izplatītas. Tie tika atzīmēti starp klonālās līnijas US-1 izolātiem populācijās no Nīderlandes (Drenth et al., 1994), Peru (Goodwin et al., 1995a), Polijas (Sujkowski et al., 1991), Ziemeļamerikas ziemeļiem (Goodwin et al. ., 1995b). Atšķirības kartupeļu virulences gēnu skaitā tika novērotas arī starp klonālo līniju US-7 un US-8 izolātiem Kanādā un Amerikas Savienotajās Valstīs (Goodwin et al., 1995a), starp SIB-1 līnijas izolātiem Krievijas Āzijas daļā (Elansky et al, 2001 ).
Izolāti ar izteiktām rezistences pret fenilamīda zālēm līmeņu atšķirībām tika noteikti monoklonālo lauku populācijās, kuras visas piederēja klonālajai līnijai Sib-1 (Elansky et al, 2001, 1. tabula). Gandrīz visi klonālās līnijas US-1 celmi ir ļoti uzņēmīgi pret metalaksilu, tomēr ļoti izturīgi šīs līnijas izolāti tika izolēti Filipīnās (Koh et al., 1994) un Īrijā (Goodwin et al., 1996).
Mūsdienu P. infestans populācijas
Centrālamerika (Meksika)
P. infestans populācija Meksikā ievērojami atšķiras no citām pasaules populācijām, kas galvenokārt ir saistīts ar tās vēsturisko stāvokli. Daudzi pētījumi par šo populāciju un radniecīgajām Phytophthora klimata P. infestans sugām, kā arī vietējām Solanum ģints sugām ļāva secināt, ka patogēna attīstība Meksikas centrālajā daļā notika vienlaikus ar saimniekaugu evolūciju un bija saistīta ar seksuālo rekombināciju (Grünwald, Flier , 2005). Abi pārošanās veidi ir pārstāvēti populācijā un vienādās proporcijās, un oosporu klātbūtne augsnē, uz kartupeļu augiem un bumbuļiem un savvaļā augošām radniecīgām sugām Solanum apstiprina dzimumprocesa klātbūtni populācijā (Fernández-Pavía et al., 2002). Jaunākie Tolukas ielejas un tās apkārtnes (iespējamā patogēna izcelsmes centra) pētījumi apstiprināja P. infestans vietējās populācijas augsto ģenētisko daudzveidību (134 multilokusa genotipi 176 paraugu izlasē) un vairāku diferencētu apakšpopulāciju klātbūtni reģionā (Wang et al., 2017). Faktori, kas veicina šo diferenciāciju, ir apakšpopulāciju telpiskais sadalījums, kas raksturīgs Meksikas centrālajai daļai, kultivēšanas apstākļu atšķirības un ielejās un kalnos izmantotās kartupeļu šķirnes, kā arī savvaļas bumbuļveida Solanum sugu klātbūtne, kas var darboties kā alternatīvi saimnieki (Fry et al ., 2009).
Tomēr jāatzīmē, ka P. infestans populācijas Meksikas ziemeļos ir vairāk klonālas un ir vairāk līdzīgas Ziemeļamerikas populācijām, kas var norādīt, ka šie ir jaunie genotipi (Fry et al., 2009).
Ziemeļamerika
Ziemeļamerikas P. infestans populācijām vienmēr ir bijusi ļoti vienkārša struktūra, un to kloniskais raksturs tika noteikts ilgi pirms mikrosatelītu analīzes izmantošanas. Līdz 1987. gadam ASV un Kanādā dominēja klonālā līnija US-1 (Goodwin et al., 1995). 70. gadu vidū, kad parādījās uz metalaksila bāzes veidoti fungicīdi, šo klonu sāka aizstāt citi, izturīgāki genotipi, kas migrēja no Meksikas (Goodwin et al., 1998). Līdz 90. gadu beigām. ASV-8 genotips pilnībā aizstāja ASV-1 genotipu Amerikas Savienotajās Valstīs un kļuva par kartupeļu dominējošo klonālo līniju (Fry et al., 2009; Fry et al., 2015). Situācija bija atšķirīga ar tomātiem, kuros pastāvīgi bija vairākas klonālās līnijas, un to sastāvs gadu no gada mainījās (Fry et al., 2009).
2009. gadā Amerikas Savienotajās Valstīs uz tomātiem sākās plaša vēla sērgas epidēmija. Šīs pandēmijas iezīme bija tās gandrīz vienlaicīga sākšanās daudzviet Amerikas Savienoto Valstu ziemeļaustrumos, un izrādījās, ka tā ir saistīta ar masveida inficēto tomātu stādu pārdošanu lielos dārzu centros (Fry et al., 2013). Ražas zudumi bija milzīgi. Ietekmēto paraugu mikrosatelītu analīze atklāja, ka pandēmijas celms piederēja klonālās līnijas US-22 A2 tipa pārošanai. 2009. gadā šī genotipa īpatsvars P. infestans amerikāņu populācijā sasniedza 80% (Fry et al., 2013). Turpmākajos gados agresīvi genotipu US-23 (galvenokārt tomātiem) un US-24 (uz kartupeļiem) īpatsvars populācijā nepārtraukti pieauga, tomēr pēc 2011. gada ASV-24 atklāšanas līmenis ievērojami samazinājās, un līdz šim aptuveni 90% no patogēnu populācijas Amerikas Savienotās Valstis pārstāv US-23 genotips (Fry et al., 2015).
Kanādā, tāpat kā Amerikas Savienotajās Valstīs, 90. gadu beigās. dominējošo genotipu US-1 aizstāja US-8, kura dominējošās pozīcijas nemainījās līdz 2008. gadam. Kanādā bija nopietnas vēlīnās pūtes epidēmijas, kas saistītas ar inficēto tomātu stādu pārdošanu, taču tās izraisīja US-2009 un US-2010 genotipi (Kalischuk et al., 23). Šo genotipu skaidra ģeogrāfiskā diferenciācija bija ievērojama: ASV-8 dominēja Kanādas rietumu provincēs (2012%), savukārt ASV-23 dominēja austrumu provincēs (68%). Turpmākajos gados ASV-8 izplatījās austrumu reģionos, tomēr kopumā tā īpatsvars populācijā nedaudz samazinājās, ņemot vērā US-83 un US-23 genotipu parādīšanos valstī (Peters et al., 22). Līdz šim ASV-24 saglabā dominējošu stāvokli visā Kanādā; ASV-2014 atrodas Britu Kolumbijā, savukārt ASV-23 un ASV-8 - Ontārio (Peters, 23).
Tādējādi Ziemeļamerikas P. infestans populācijas galvenokārt ir klonālas līnijas. Pēdējo 40 gadu laikā atklāto klonālo genotipu skaits ir sasniedzis 24. Neskatoties uz to, ka populācijā ir abu pārošanās veidu celmi, jaunu genotipu parādīšanās varbūtība seksuālās rekombinācijas rezultātā joprojām ir diezgan zema. Neskatoties uz to, pēdējo 20 gadu laikā ir reģistrēti vairāki īslaicīgu rekombinanto populāciju parādīšanās gadījumi (Gavino et al., 2000; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014), un vienā gadījumā šķērsošanas rezultāts bija US-11 genotips. , kas daudzus gadus bija iesakņojusies Ziemeļamerikā (Gavino et al., 2000). Līdz 2009. gadam populāciju struktūras izmaiņas bija saistītas ar jaunu, agresīvāku genotipu parādīšanos ar to turpmāko migrāciju un iepriekš dominējošo priekšgājēju pārvietošanu. Kas notika 2009.-2010 ASV un Kanādā epifītiķi pirmo reizi parādīja, ka globalizācijas laikmetā, pārdodot inficēto stādāmo materiālu, slimības uzliesmojumus var saistīt ar jaunu genotipu aktīvu izplatīšanos.
Dienvidamerika
Vēl nesen pētījumi par Dienvidamerikas P. infestans populācijām nebija ne regulāri, ne plaši. Ir zināms, ka šo populāciju struktūra ir diezgan vienkārša un ietver 1-5 klonālās līnijas katrai valstij (Forbes et al., 1998). Tātad līdz 1998. gadam genotipi US-1 (Brazīlija, Čīle) BR-1 (Brazīlija, Bolīvija, Urugvaja, Paragvaja), EC-1 (Ekvadora, Kolumbija, Peru un Venecuēla), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 un AR-5 (Argentīna), PE-3 un PE-7 (Peru dienvidos). Pārošanās veids A2 bija Brazīlijā, Bolīvijā un Argentīnā, un tas netika atrasts aiz Bolīvijas un Peru robežas Titikakas ezera zonā, aiz kura Andos dominēja EC-1 A1 genotips. Tomātiem ASV-1 joprojām bija dominējošais genotips visā Dienvidamerikā.
Situācija vairāk vai mazāk saglabājās 2000. gados. Svarīgs punkts bija jaunas A2 tipa klonālās līnijas EC-2 atklāšana kartupeļu savvaļas radiniekiem (S. brevifolium un S. tetrapetalum) Ziemeļu Andos (Oliva et al., 2010). Filoģenētiskie pētījumi ir parādījuši, ka šī līnija nav pilnīgi identiska P. infestans, kaut arī tā ir cieši saistīta, šajā sakarā tika ierosināts to uzskatīt, kā arī citu līniju EC-3, kas izolēta no Andos augošā tomātu koka S. betaceum, jauna suga ar nosaukumu P. andina; tomēr šīs sugas statuss (neatkarīga suga vai P. infestans hibrīds ar kādu vēl nezināmu līniju) joprojām nav skaidrs (Delgado et al., 2013).
Pašlaik visas Dienvidamerikas P. infestans populācijas ir klonālas. Neskatoties uz abu pārošanās veidu klātbūtni, rekombinantās populācijas nav noteiktas. Tomātiem US-1 genotips ir visuresošs, acīmredzot no kartupeļiem to ir aizstājuši vietējie celmi, kuru precīza izcelsme joprojām nav zināma. Brazīlijā, Bolīvijā un Urugvajā ir BR-1 genotips; Peru kopā ar US-1 un EC-1 ir vairāki citi vietējie genotipi. Andos dominējošo stāvokli saglabā klonālā līnija EC-1, kuras attiecības ar nesen atklāto P. andinu joprojām nav izpētītas. Vienīgā "nestabilā" vieta, kur laika posmā no 2003. līdz 2013. gadam. notika būtiskas iedzīvotāju skaita izmaiņas, kļuva Čīle (Acuña et al., 2012), kur 2004.-2005. patogēnu populāciju raksturoja rezistence pret metalaksilu un jauns mitohondriju DNS haplotips (Ia iepriekš esošā Ib vietā). 2006. līdz 2011. gadam populācijā dominēja 21. genotips (pēc SSR datiem), kura īpatsvars sasniedza 90%, pēc tam palma pārgāja uz 20. genotipu, kura sastopamības biežums nākamajos divos gados tika turēts aptuveni 67% (Acuña, 2015).
Eiropa
Eiropas vēsturē bija vismaz divi P. infestans migrācijas viļņi no Ziemeļamerikas: 1. gadsimtā. (HERB-1) un 70. gadsimta sākumā (US-1). Metalaksilu saturošo fungicīdu visuresošais sadalījums XNUMX. gados. izraisīja dominējošā US-XNUMX genotipa pārvietošanu un tā aizstāšanu ar jauniem genotipiem. Tā rezultātā lielākajā daļā Rietumeiropas valstu patogēnu populācijas galvenokārt pārstāvēja vairākas kloniskas līnijas.
Mikrosatelītu analīzes izmantošana patogēnu populāciju analīzei ļāva atklāt nopietnas izmaiņas, kas notika Rietumeiropā 2005.-2008. Gadā. 2005. gadā Lielbritānijā tika atklāta jauna klonālā līnija ar nosaukumu 13_A2 (vai “Blue 13”), kurai raksturīgs A2 pārošanās tips. , augsta agresivitāte un izturība pret fenilamīdiem (Shaw et al., 2007). Tas pats genotips tika atrasts 2004. gadā Nīderlandē un Francijas ziemeļdaļā savāktajos paraugos, kas liecināja, ka tas migrēja uz Lielbritāniju no kontinentālās Eiropas, iespējams, ar sēklas kartupeļiem (Cooke et al., 2007). Šīs klonālās līnijas pārstāvju genoma izpēte parādīja augstu tās secības polimorfismu (līdz 2016. gadam tās subklonālo variāciju skaits sasniedza 340) un ievērojamu gēnu ekspresijas līmeņa variāciju, t.sk. efektorgēni augu infekcijas laikā (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Šīs pazīmes kopā ar palielinātu biotrofiskās fāzes ilgumu var izraisīt paaugstinātu 13_A2 agresivitāti un tā spēju inficēt pat kartupeļu šķirnes, kas izturīgas pret vēlu iedegu.
Dažu nākamo gadu laikā genotips ātri izplatījās visā Ziemeļrietumu Eiropas valstīs (Lielbritānijā, Īrijā, Francijā, Beļģijā, Nīderlandē, Vācijā), vienlaikus pārvietojot iepriekš dominējošos genotipus 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch et al., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Saskaņā ar vietni www.euroblight.net, 13_A2 īpatsvars šo valstu populācijās sasniedza 60-80% un vairāk; šī genotipa klātbūtne ir reģistrēta arī dažās Austrumeiropas un Dienvideiropas valstīs. Tomēr 2009. – 2012. 13_A2 zaudēja dominējošās pozīcijas Lielbritānijā un Francijā, piekāpjoties 6_A1 līnijai (8_A1 Īrijā), un Nīderlandē un Beļģijā to daļēji aizstāja genotipi 1_A1, 6_A1 un 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Līdz šim aptuveni 70% no Rietumeiropas populācijas P. infestans ir monoklonāli. Saskaņā ar vietni www.euroblight.net, dominējošie genotipi Ziemeļrietumu Eiropas valstīs (Lielbritānijā, Francijā,
Nīderlande, Beļģija) paliek aptuveni vienādās proporcijās 13_A2 un 6_A1, pēdējais praktiski nav atrodams ārpus norādītā reģiona (izņemot Īriju), bet tam jau ir vismaz 58 apakškloni (Cooke, 2017). Variācijas 13_A2 ir pamanāmas daudzos Vācijā, un tās sporādiski novēro arī Centrāleiropas un Dienvideiropas valstīs. Genotips 1_A1 veido ievērojamu daļu Beļģijas, daļēji Nīderlandes un Francijas populāciju. 8_A1 genotips Eiropas populācijā ir stabilizējies 3-6% līmenī, izņemot Īriju, kur tas saglabā līderpozīcijas un ir sadalīts divos apakšklonos (Stellingwerf, 2017). Visbeidzot, 2016. gadā tika atzīmēts jaunu genotipu 36_A2 un 37_A2 sastopamības biežuma pieaugums, kas pirmo reizi reģistrēts 2013.-2014. līdz šim šie genotipi ir sastopami Nīderlandē un Beļģijā un daļēji Francijā un Vācijā, kā arī Lielbritānijas dienvidu daļā (Cooke, 2017). Katru gadu aptuveni 20-30% Rietumeiropas iedzīvotāju pārstāv unikāli genotipi.
Atšķirībā no Rietumeiropas, līdz brīdim, kad parādījās 13_A2 genotips, Ziemeļeiropas populācijas (Zviedrija, Norvēģija, Dānija, Somija) pārstāvēja nevis klonālas līnijas, bet gan liels skaits unikālu genotipu (Brurberg et al.
2011). Laikā, kad 13_A2 aktīvi izplatījās Rietumeiropā, šī genotipa klātbūtne Skandināvijā tika novērota tikai 2011. gadā, kad tas pirmo reizi tika atklāts Ziemeļjitlandē (Dānijā), kur galvenokārt tiek audzētas rūpnieciskās kartupeļu šķirnes, aktīvi lietojot metalaksilu saturošus fungicīdi (Nielsen et al., 2014). Kā ziņo www.euroblight.net, genotips 13_A2 tika atklāts arī vairākos paraugos no Norvēģijas un Dānijas 2014. gadā un vairākos Norvēģijas paraugos 2016. gadā; turklāt 2013. gadā Somijā tika konstatēta 6_A1 genotipa klātbūtne nelielā daudzumā. Galvenais 13_A2 un citu klonālo līniju izgāšanās iemesls Skandināvijas iekarošanā tiek uzskatīts par šī reģiona klimatiskajām atšķirībām no Rietumeiropas valstīm.
Papildus tam, ka vēsas vasaras un aukstās ziemas veicina oosporu, nevis veģetatīvās micēlijas izdzīvošanu (Sjöholm et al., 2013), augsnes sasalšana ziemā (kas parasti nenotiek siltākajās Rietumeiropas valstīs) veicina oosporu dīgšanas un stādīšanas sinhronizāciju. kartupeļu, kas pastiprina to kā primārās infekcijas avota lomu (Brurberg et al., 2011). Jāatzīmē arī tas, ka ziemeļu apstākļos oosporu infekcijas attīstība pārsniedz bumbuļu infekcijas attīstību, kas galu galā novērš vēl agresīvāku, bet vēlāk attīstītu klonu līniju dominēšanu (Yuen, 2012). Austrumeiropā (Polijā, Baltijas valstīs) visvairāk pētīto P. infestans populāciju struktūra ir ļoti līdzīga Skandināvijas struktūrai.
Šeit ir sastopami arī abi pārošanās veidi, un lielākā daļa SSR analīzē noteikto genotipu ir unikāli (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Tāpat kā Ziemeļeiropā, arī klonālo līniju (galvenokārt 13_A2 genotipa) izplatība praktiski neietekmēja lokālās patogēna populācijas, kas saglabā augstu daudzveidības līmeni, nepastāvot izteiktām dominējošām līnijām.
Laukos ar komerciālo kartupeļu šķirnēm dažreiz novēro 13_A2 klātbūtni. Krievijā situācija attīstās līdzīgi. P. infestans izolātu mikrosatelītu analīze, kas savākta 2008.-2011 10 dažādos Krievijas Eiropas daļas reģionos parādīja augstu genotipiskās daudzveidības pakāpi un pilnīgu sakritību trūkumu ar Eiropas klonālajām līnijām (Statsyuk et al., 2014). Pēc vairākiem gadiem pētījums par P. infestans paraugiem, kas savākti Ļeņingradas apgabalā 2013. – 2014. Gadā, parādīja būtiskas atšķirības starp tiem un iepriekšējā pētījumā identificētajiem šī reģiona genotipiem. Abos pētījumos Rietumeiropas genotipi netika atrasti (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
P. infestans Austrumeiropas populāciju augstā ģenētiskā daudzveidība un dominējošo klonālo līniju trūkums tajās var būt vairāku iemeslu dēļ. Pirmkārt, tāpat kā Ziemeļeiropā, aplūkoto valstu klimatiskie apstākļi veicina oosporu veidošanos kā primāru infekcijas avotu (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). Otrkārt, ievērojama daļa šajās valstīs ražoto kartupeļu tiek audzēti nelielās privātās saimniecībās, kuras bieži ieskauj meži vai citi šķēršļi infekcijas materiāla brīvai apritei (Chmielarz et al., 2014). Parasti šādos apstākļos audzētus kartupeļus praktiski neapstrādā ar ķīmiskajām vielām, un šķirņu izvēle ir balstīta uz to izturību pret vēlīnām pūtītēm, t.i. nav selektīva spiediena uz agresivitāti un izturību pret metalaksilu, kas atņem rezistentiem genotipiem, piemēram, 13_A2, priekšrocības salīdzinājumā ar citiem genotipiem (Chmielarz et al., 2014). Visbeidzot, zemes gabalu mazā lieluma dēļ to īpašnieki parasti nepraktizē augseku, gadiem ilgi audzējot kartupeļus tajā pašā vietā, kas veicina ģenētiski daudzveidīga sējmateriāla uzkrāšanos (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Āzija
Vēl nesen Āzijas P. infestans populācijas struktūra joprojām bija samērā slikti izprasta. Bija zināms, ka to galvenokārt pārstāv klonālās līnijas, un seksuālās rekombinācijas ietekme uz jaunu genotipu parādīšanos ir ļoti maza. Tā, piemēram, 1997.-1998. Krievijas Āzijas daļā (Sibīrijā un Tālajos Austrumos) patogēnu populāciju pārstāvēja tikai trīs genotipi ar pārsvaru SIB-1 genotipā (Elansky et al., 2001). Klonālo patogēnu līniju klātbūtne ir parādīta tādās valstīs kā Ķīna, Japāna, Koreja, Filipīnas un Taivāna (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Klonālā līnija US-1 90. gadu beigās - 2000. gadu sākumā dominēja lielā Āzijas teritorijā. gandrīz visur sāka aizstāt citi genotipi, kas, savukārt, atdeva vietu jauniem. Vairumā gadījumu Āzijas valstu populācijas struktūras un sastāva izmaiņas bija saistītas ar jaunu genotipu migrāciju no ārpuses. Tātad Japānā, izņemot JP-3 genotipu, visiem pārējiem japāņu genotipiem, kas parādījās pēc US-1 (JP-1, JP-2, JP-3), ir vairāk vai mazāk pierādīta ārējā izcelsme (Akino et al., 2011) ... Pašlaik Ķīnā ir trīs galvenās patogēnu populācijas, kurām ir skaidrs ģeogrāfiskais sadalījums; Starp šīm populācijām nav vai ir ļoti vāja gēnu plūsma (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Genotips 13_A2 parādījās Ķīnas teritorijā tās dienvidu provincēs (Junanā un Sičuaņā) 2005.-2007. Gadā un 2012.-1014. bija redzams arī valsts ziemeļaustrumos (Li et al., 2013b). Indijā, domājams, 13_A2 parādījās vienlaikus ar Ķīnu, visticamāk, ar inficētiem sēklas kartupeļiem (Chowdappa et al., 2015), un 2009.-2010. izraisīja nopietnu vēlīnās drudža epifitozi tomātiem valsts dienvidos, pēc tam tas izplatījās kartupeļos un 2014. gadā izraisīja vēlīnās iedegas uzliesmojumu Rietumbengālijā, kas izraisīja daudzu vietējo lauksaimnieku sagraušanu un pašnāvību (Fry, 2016).
Āfrika
Līdz 2008.-2010 sistemātiski P. infestans pētījumi Āfrikas valstīs nav veikti. Pašlaik Āfrikas P. infestans populācijas var iedalīt divās grupās, un šī dalīšana ir skaidri saistīta ar sēklas kartupeļu importa faktu no Eiropas.
Ziemeļāfrikā, kas aktīvi importē sēklas kartupeļus no Eiropas, A2 pārošanās veids ir plaši pārstāvēts gandrīz visos reģionos, kas nodrošina teorētisku iespēju jaunu genotipu parādīšanās dzimumkombinācijas rezultātā (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Turklāt Alžīrijā tiek atzīmēta 13_A2, 2_A1 un 23_A1 genotipu klātbūtne ar izteiktu pirmā dominanci, kā arī pakāpenisku unikālo genotipu īpatsvara samazināšanos līdz pilnīgai izzušanai (Rekad et al., 2017). Atšķirībā no pārējā reģiona Tunisijā (izņemot valsts ziemeļaustrumus) patogēnu populāciju galvenokārt pārstāv A1 pārošanās tips (Harbaoui et al., 2014).
Šeit dominējošā ir klonālā līnija NA-01. Kopumā klonālo līniju īpatsvars populācijā ir tikai 43%. Austrumāfrikā un Dienvidāfrikā, kur sēklu importa apjoms ir pazūdoši mazs (Fry et al., 2009), P. infestans pārstāv tikai divas klonālas A1 tipa līnijas - US-1 un KE-1, un pēdējās aktīvi izspiež pirmo uz kartupeļiem ( Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). Līdz šim abiem šiem genotipiem ir ievērojams skaits subklonālo variāciju.
Austrālija
Pirmais ziņojums par vēlīno kartupeļu puvi Austrālijā datēts ar 1907. gadu, un pirmā epifitotija, kuru, domājams, izraisīja spēcīgas lietavas vasaras mēnešos, notika 1909.-1911. (Drenth et al., 2002). Tomēr vēlīnai pūtītei valstij nav būtiskas ekonomiskas nozīmes. Sporādiski vēlīnā pūtuma uzliesmojumi, ko izraisa laika apstākļi, kas nodrošina augstu mitrumu, notiek ne biežāk kā reizi 5-7 gados un lokalizēti galvenokārt Tasmānijas ziemeļos un Viktorijas centrā. Saistībā ar iepriekš minēto praktiski nav publikāciju, kas veltītas Austrālijas P. infestans populācijas struktūras izpētei. Jaunākā pieejamā informācija ir no 1998. līdz 2000. gadam. (Drenth et al., 2002). Pēc autoru domām, Viktorijas štata populācija bija klonālā līnija US-1.3, kas netieši apstiprināja šī genotipa migrāciju no Amerikas Savienotajām Valstīm. Tasmānijas paraugi tika klasificēti kā AU-3, atšķirīgi no genotipiem, kas tajā laikā bija sastopami citās pasaules daļās.
Vēlīnā drudža attīstības iezīmes Krievijā
Eiropā infekcija, ko ieviesa ar slimiem sēklu bumbuļiem, oosporām, kuras pārziemoja augsnē, kā arī zoosporangijas, ko vējš atnesa no augiem, kas pagājušā gada laukos audzēti no pārziemotiem bumbuļiem ("brīvprātīgo" augi), vai uz nokautām kaudzēm. grāmatzīme bumbuļu uzglabāšanai. No tiem augus, kas audzēti uz izmestiem bumbuļiem, uzskata par visbīstamāko infekcijas avotu. tur bieži sadīgušu bumbuļu skaits ir ievērojams, un zoosporangijas no tiem var pārvadāt lielos attālumos. Pārējie avoti (oosporas, "brīvprātīgo" augi) nav tik bīstami, jo nav ierasts audzēt augus tajos pašos laukos biežāk kā reizi 3-4 gados. Infekcija no slimiem sēklu bumbuļiem ir arī minimāla, pateicoties labai sēklu kvalitātes kontroles sistēmai.
Kopumā inokulāta daudzums Eiropas populācijās ir ierobežots, un tāpēc epidēmijas pieaugums ir diezgan lēns, un to var veiksmīgi kontrolēt, izmantojot ķīmiskos fungicīdus. Galvenais uzdevums Eiropas apstākļos ir cīņa pret infekciju fāzē, kad sākas masveida zoosporangijas izplatīšanās no skartajiem augiem.
Krievijā situācija ir radikāli atšķirīga. Lielāko daļu kartupeļu un tomātu ražas audzē nelielos privātajos dārzos; vai nu vispār netiek veikti aizsargpasākumi, vai arī fungicīdās procedūras tiek veiktas nepietiekamā skaitā un sākas pēc vēlīnā pūtuma parādīšanās virsotnēs. Tā rezultātā privātie dārzeņu dārzi darbojas kā galvenais infekcijas avots, no kura zoosporangijas vējš nogādā komerciālos stādījumos. To apstiprina mūsu tiešie novērojumi Maskavā, Brjanskā, Kostromā, Rjazaņas reģionos: augu bojājumi privātajos dārzos tiek novēroti pat pirms komerciālo stādījumu fungicīdu ārstēšanas sākuma. Pēc tam epidēmiju lielos laukos ierobežo fungicīdu preparātu lietošana, savukārt privātajos dārzos strauji attīstās vēlīnā pūtīte.
Nepareizas vai "budžeta" apstrādes gadījumā komerciālos stādījumos laukos parādās arī vēlīnās iedeguma perēkļi; vēlāk viņi aktīvi attīstās, aptverot arvien lielākas teritorijas (Elansky, 2015). Infekcija privātajos dārzos būtiski ietekmē epidēmijas komerciālos laukos. Visos Krievijas kartupeļu audzēšanas reģionos kartupeļu platība privātajos dārzos ir vairākas reizes lielāka nekā lielo ražotāju lauku kopējā platība. Šādā vidē privātos dārzeņu dārzus var uzskatīt par globālu sējmateriālu resursu komerciāliem laukiem. Mēģināsim noteikt tās īpašības, kas raksturīgas privāto dārzu celmu genotipiem.
Tādu pārtikas kartupeļu, tomātu sēklu, kas iegūti no apšaubāmiem ārvalstu ražotājiem, sēklu un karantīnas kontroles stādīšana, kartupeļu un tomātu ilgstoša audzēšana tajos pašos apgabalos, nepareiza fungicīdu apstrāde vai pilnīga to neesamība privātajā sektorā izraisa smagas epifitoties, kuras rezultāts ir bez maksas krustošana, hibridizācija un oosporu veidošanās privātajos dārzos. Rezultātā tiek novērota ļoti augsta patogēna genotipiskā daudzveidība, kad gandrīz katrs celms ir unikāls savā genotipā (Elansky et al., 2001, 2015). Stādot dažādas ģenētiskas izcelsmes sēklas kartupeļus, maz ticams, ka parādīsies kloniskas līnijas, kas specializējušās uzbrukumam noteiktai šķirnei. Šādā gadījumā atlasītie celmi atšķiras ar to daudzpusību attiecībā uz ietekmētajām šķirnēm, lielākajai daļai no tiem ir tuvu maksimālajam virulences gēnu skaitam. Tas ļoti atšķiras no "klonālo līniju" sistēmas, kas raksturīga lieliem lauksaimniecības uzņēmumu laukiem ar pareizi uzstādītu aizsardzības sistēmu pret vēlu puvi. "Klonālās līnijas" (kad visus vēlīnās sērgas patogēna celmus laukā pārstāv viens vai vairāki genotipi) ir visuresoši valstīs, kur kartupeļu audzēšanu veic tikai lielās saimniecības: ASV, Nīderlandē, Dānijā uc. Anglijā, Īrijā, Polijā, kur tradicionāli ir izplatīti arī mājsaimniecības zemes gabali kartupeļu audzēšana, privātajos dārzos ir arī lielāka genotipa daudzveidība. 20. gadsimta beigās Krievijas Āzijas un Tālo Austrumu daļās bija plaši izplatītas "klonālās līnijas" (Elansky et al., 2001), kas acīmredzot ir saistīts ar to pašu kartupeļu šķirņu izmantošanu tikai stādīšanai. Nesen situācija šajos reģionos arī sāka mainīties, palielinoties populāciju genotipiskajai daudzveidībai.
Intensīvas ārstēšanas ar fungicīdiem preparātiem trūkumam ir citas tiešas sekas - dārzos nav rezistentu celmu uzkrāšanās. Patiešām, mūsu rezultāti rāda, ka pret metalaksilu izturīgi celmi privātajos dārzos tiek atrasti ievērojami retāk nekā komerciālos stādījumos.
Privātajiem dārziem raksturīgais kartupeļu un tomātu stādījumu tuvums atvieglo celmu migrāciju starp šīm kultūrām, kā rezultātā pēdējā desmitgadē no kartupeļiem izolēto celmu celmu īpatsvars, kas satur gēnu pretestībai ķiršu tomātu šķirnēm (T1), kas iepriekš bija raksturīgs tikai " tomātu "celmi. Celmi ar T1 gēnu vairumā gadījumu ir ļoti agresīvi gan pret kartupeļiem, gan tomātiem.
Pēdējos gados novēlota saslimšana ar tomātiem daudzos gadījumos sāka parādīties agrāk nekā kartupeļiem. Tomātu stādus var inficēt ar oosporām augsnē vai ar oosporām, kas atrodas tomātu sēklās vai tām pielipušas (Rubin et al., 2001). Pēdējo 15 gadu laikā veikalos ir parādījies liels skaits lētu, galvenokārt ievestu, iesaiņotu sēklu, un lielākā daļa mazo ražotāju ir pārgājuši uz to lietošanu. Sēklas var saturēt celmus ar genotipiem, kas raksturīgi to audzēšanas reģioniem. Nākotnē šie genotipi tiek iekļauti seksuālajā procesā privātajos dārzos, kas noved pie pilnīgi jaunu genotipu parādīšanās.
Tādējādi var apgalvot, ka privātie dārzi ir globāls "kausēšanas katls", kurā ģenētiskā materiāla apmaiņas rezultātā tiek apstrādāti esošie genotipi un parādās pilnīgi jauni. Turklāt to atlase notiek apstākļos, kas ļoti atšķiras no tiem, kas tiek radīti kartupeļiem lielajās saimniecībās: fungicīdas preses neesamība, stādījumu šķirnes viendabīgums, dažādu vīrusu un baktēriju infekcijas skarto augu pārsvars, tomātu un savvaļas nakteņu tuvums, aktīva krustošana un oosporu veidošanās, iespēja lai oosporas darbotos kā infekcijas avots nākamajam gadam.
Tas viss noved pie ļoti augstas piemājas populāciju genotipiskās daudzveidības. Augu dārzu epifitotiku apstākļos vēlīnā pūtīte izplatās ļoti ātri un izdalās milzīgs daudzums sporu, kas lido uz tuvējiem komerciālajiem stādījumiem. Tomēr, nonākot komerciālos laukos ar pareizu lauksaimniecības tehnoloģiju un ķīmiskās aizsardzības sistēmu, atnākušajām sporām praktiski nav iespēju uzsākt epifitotiku laukā, kas ir saistīts ar klonisko līniju trūkumu, kas būtu izturīgi pret fungicīdiem un būtu specializējušies kultivētajai šķirnei.
Cits primārā sējmateriāla avots var būt slimi bumbuļi, kas iesprostoti komerciālajos stādos. Šie bumbuļi parasti tika audzēti laukos ar labu lauksaimniecības tehnoloģiju un intensīvu ķīmisko aizsardzību. Izolātu, kas skāra bumbuļus, genotipi ir pielāgoti viņu pašu šķirnes attīstībai. Šie celmi ir daudz bīstamāki komerciālai stādīšanai nekā sējmateriāli, kas nāk no privātiem dārziem. Arī mūsu pētījumu rezultāti apstiprina šo pieņēmumu. Populācijas, kas izolētas no lieliem laukiem ar pareizi veiktu ķīmisko aizsardzību un labu lauksaimniecības tehnoloģiju, neatšķiras ar augstu genotipa daudzveidību. Bieži vien tās ir vairākas ļoti agresīvas klonālās līnijas.
Celmi no komerciālā sēklu materiāla var iekļūt augu dārzu populācijās un iesaistīties tajos notiekošajos procesos. Tomēr dārzeņu dārzā viņu konkurētspēja būs daudz zemāka nekā komerciālā jomā, un drīz viņi pārstās eksistēt klonālas līnijas formā, taču viņu gēnus var izmantot “dārzu” populācijā.
Infekcija, kas ražas novākšanas laikā attīstās uz "brīvprātīgajiem" augiem un uz nokauto bumbuļu kaudzēm, Krievijai nav tik aktuāla, jo Galvenajos Krievijas kartupeļu audzēšanas reģionos ir vērojama dziļa ziemas augsnes sasalšana, un augi no bumbuļiem, kas ziemojuši augsnē, reti attīstās. Turklāt, kā liecina mūsu eksperimenti, vēlīnās slimības izraisītājs neizdzīvo negatīvā temperatūrā pat uz bumbuļiem, kas ir saglabājuši savu dzīvotspēju. Sausajā zonā, kur praktizē agro kartupeļu audzēšanu, sausā un karstā augšanas perioda dēļ vēlīnā pūtīte notiek diezgan reti.
Tādējādi mēs šobrīd novērojam P. infestans populāciju sadalījumu “lauka” un “dārza” populācijās. Tomēr pēdējos gados ir novēroti procesi, kas noved pie šo populāciju genotipu konverģences un savstarpējas iekļūšanas.
Starp tiem var atzīmēt vispārēju mazo ražotāju lasītprasmes pieaugumu, pieejamu mazu sēklas kartupeļu iepakojumu parādīšanos, fungicīdu preparātu izplatīšanos mazos iepakojumos un iedzīvotāju zaudētās bailes no “ķīmijas”.
Situācijas rodas, kad, pateicoties viena piegādātāja enerģiskai darbībai, veseli ciemati tiek apstādīti ar vienas šķirnes sēklu bumbuļiem un tiek nodrošināti ar maziem to pašu pesticīdu iepakojumiem. Var pieņemt, ka blakus esošajos komerciālajos stādījumos būs atrodami vienas un tās pašas šķirnes kartupeļi.
No otras puses, daži pesticīdu tirdzniecības uzņēmumi veicina "budžeta" ķīmiskās apstrādes shēmas. Šajā gadījumā tiek nepietiekami novērtēts ieteicamo ārstēšanas veidu skaits un tiek piedāvāti lētākie fungicīdi, un uzsvars netiek likts uz vēlīnās iedeguma attīstības novēršanu līdz galu pļaušanai, bet gan uz noteiktu epifitotozes aizkavēšanos, lai palielinātu ražu. Šādas shēmas ir ekonomiski pamatotas, audzējot trauku kartupeļus no zemas kvalitātes sēklu materiāla, kad principā nav runas par augstas ražas iegūšanu. Tomēr šajā gadījumā, atšķirībā no dārza populācijām, kartupeļu izlīdzinātais ģenētiskais fons veicina konkrētu fizioloģisko rasu izvēli, kas ir ļoti bīstami šai šķirnei.
Kopumā tendences uz "dārza" un "lauka" kartupeļu ražošanas metožu konverģenci mums šķiet diezgan bīstamas. Lai novērstu to negatīvās sekas gan mājas, gan tirdzniecības nozarēs, būs jākontrolē gan sēklas kartupeļu sortiments, gan privātīpašniekiem piedāvāto fungicīdu klāsts mazos iepakojumos, kā arī kartupeļu aizsardzības shēmu izsekošana un fungicīdu izmantošana komerciālajā nozarē.
Privātā sektora teritorijās intensīvi attīstās ne tikai vēlīnā sērga, bet arī Alternaria. Lielākā daļa privāto zemes gabalu īpašnieku neveic īpašus pasākumus, lai pasargātu no Alternaria, kļūdaini uzskatot Alternaria attīstību ar virsotņu dabisko novītušanos vai vēlīnās sērgas attīstību. Tāpēc, masveidīgi attīstoties Alternaria uzņēmīgām šķirnēm, mājsaimniecības zemes gabali var kalpot kā potēšanas avots komerciāliem stādījumiem.
Mainīguma mehānismi
Mutācijas process
Tā kā mutāciju rašanās ir nejaušs process, kas notiek ar zemu frekvenci, mutāciju rašanās jebkurā lokusā ir atkarīga no šīs lokācijas mutāciju biežuma un populācijas lieluma. Pētot P. infestans celmu mutāciju biežumu, parasti nosaka koloniju skaitu, kas pēc apstrādes ar ķīmiskajiem vai fizikālajiem mutagēniem audzēti selektīvās barības vielās. Kā redzams no 8. tabulā sniegtajiem datiem, viena un tā paša celma mutāciju biežums dažādos lokusos var atšķirties par vairākām pakāpēm. Augstā mutāciju rezistence pret metalaksilu var būt viens no cēloņiem, kas izraisa dabā pret to izturīgu celmu uzkrāšanos.
Spontānu vai izraisītu mutāciju biežums, kas aprēķināts, pamatojoties uz laboratorijas eksperimentiem, ne vienmēr atbilst dabisko populāciju procesiem šādu iemeslu dēļ:
1. Ar asinhrono kodola dalīšanos nav iespējams novērtēt mutāciju biežumu uz vienu kodola paaudzi. Tāpēc lielākā daļa eksperimentu sniedz informāciju tikai par mutāciju biežumu, nenošķirot divus mutācijas notikumus un vienu notikumu pēc mitozes.
2. Vienpakāpju mutācijas parasti samazina genoma līdzsvaru, tāpēc līdz ar jauna īpašuma iegūšanu organisma vispārējā sagatavotība samazinās. Lielākajai daļai eksperimentāli iegūto mutāciju ir samazināta agresivitāte un tās netiek reģistrētas dabiskajās populācijās. Tādējādi korelācijas koeficients starp P. infestans mutantu rezistences pakāpi pret fenilamīda fungicīdiem un augšanas ātrumu mākslīgā vidē bija vidēji (-0,62), un rezistence pret fungicīdiem un agresivitāte uz kartupeļu lapām (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), kas norāda uz zemu mutantu piemērotību. Rezistences pret dimetomorfu mutācijas pavadīja arī strauja dzīvotspējas samazināšanās (Bagirova et al., 2001).
3. Lielākā daļa spontāno un izraisīto mutāciju ir recesīvas un eksperimentos tās neizpaužas fenotipiski, bet veido slēptu dabisko populāciju mainīguma rezervi. Laboratorijas eksperimentos izolētiem mutantajiem celmiem ir dominējošas vai daļēji dominējošas mutācijas (Kulish and Dyakov, 1979). Acīmredzot kodoldiploīdija izskaidro neveiksmīgus mēģinājumus UV apstarošanas ietekmē iegūt mutantus, kas ir virulenti uz iepriekš izturīgajām šķirnēm (McKee, 1969). Pēc autora aprēķiniem šādas mutācijas var notikt ar biežumu, kas mazāks par 1: 500000 XNUMX. Recesīvo mutāciju pāreja uz homozigotu, fenotipiski izteiktu stāvokli var notikt seksuālas vai aseksuālas rekombinācijas dēļ (skatīt zemāk). Tomēr pat šajā gadījumā mutāciju var maskēt savvaļas tipa kodolu dominējošās alēles cenotiskajā (daudzkodolu) micēlijā un fenotipiski fiksēt tikai mononukleāro zoosporu veidošanās laikā.
8. tabula. P. infestans mutāciju biežums augšanu inhibējošām vielām nitrozometilurīnvielas ietekmē (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Savienojums | Mutācijas biežums |
Oksitetraciklīns | 6,9 10 x-8 |
Blasticidin S | 7,2 x 10-8 |
Streptomicīns | 8,3 x10-8 |
Trihotecīns | 1,8 10 x-8 |
Cikloheksimīds | 2,1 10 x-8 |
Daakonils | <4 x 10-8 |
Dimetomorfs | 6,3 10 x-7 |
Metalaksils | 6,9 10 x-6 |
Iedzīvotāju lielumam ir arī izšķiroša loma spontānu mutāciju rašanās gadījumā. Ļoti lielās populācijās, kurās šūnu skaits N> 1 / a, kur a ir mutācijas ātrums, mutācija pārstāj būt nejauša parādība (Kvitko, 1974).
Aprēķini rāda, ka ar vidēju kartupeļu lauka invāziju (35 plankumi uz viena auga) katru dienu vienā hektārā veidojas 8x1012 sporas (Dyakov and Suprun, 1984). Acīmredzot šādas populācijas satur visas mutācijas, kuras pieļauj apmaiņas veids katrā lokusā. Pat retu mutāciju, kas notiek ar 10–9 biežumu, iegūs tūkstoš cilvēku no miljoniem, kas dzīvo vienā hektārā kartupeļu lauka. Mutācijām, kas notiek ar lielāku biežumu (piemēram, 10-6), šādā populācijā katru dienu (vienlaikus divos lokusos) var notikt dažādas pāru mutācijas, t.i. mutācijas process aizstās rekombināciju.
Migrācijas
P. infestans ir zināmi divi galvenie migrācijas veidi: tuvināt attālumus (kartupeļu laukā vai blakus esošajos laukos), zoosporangiju izplatot ar gaisa straumēm vai lietus aerosolu, un lielos attālumos - ar bumbuļu stādīšanu vai transportētiem tomātu augļiem. Pirmā metode nodrošina slimības fokusa paplašināšanos, otrā - jaunu perēkļu izveidošana vietās, kas atrodas tālu no primārā.
Infekcijas izplatīšanās ar tomātu bumbuļiem un augļiem veicina ne tikai slimības parādīšanos jaunās vietās, bet arī ir galvenais ģenētiskās daudzveidības avots populācijās. Maskavas reģionā tiek audzēti kartupeļi, kas atvesti no dažādiem Krievijas un Rietumeiropas reģioniem. Tomātu augļi tiek ievesti no Krievijas dienvidu reģioniem (Astrahaņas apgabals, Krasnodaras teritorija, Ziemeļkaukāzs). Tomātu sēklas, kas var kalpot arī kā infekcijas avoti (Rubin et al., 2001), tiek importētas arī no Krievijas dienvidu reģioniem, Ķīnas, Eiropas valstīm un citām valstīm.
Pēc E. Mayra (1974) aprēķiniem, mutāciju izraisītās ģenētiskās izmaiņas vietējā populācijā reti pārsniedz 10-5 vienā lokusā, savukārt atvērtās populācijās apmaiņa gēnu pretplūsmas dēļ ir vismaz 10-3 - 10-4.
Migrācija inficētos bumbuļos ir atbildīga par P. infestans iekļūšanu Eiropā, izplatoties visos pasaules reģionos, kur audzē kartupeļus; tie izraisīja visnopietnākās iedzīvotāju izmaiņas. Vēlā kartupeļu drudzis Krievijas impērijas teritorijā parādījās gandrīz vienlaikus ar tā parādīšanos Rietumeiropā.
Tā kā šī slimība pirmo reizi tika atzīmēta 1846.-1847. Gadā Baltijas valstīs un tikai turpmākajos gados izplatījās Baltkrievijā un Krievijas ziemeļrietumu reģionos, tās Rietumeiropas izcelsme ir acīmredzama. Pirmais vēlās drudža avots Vecajā pasaulē nav tik acīmredzams. Hipotēze, ko izstrādājuši Fry et al. (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin et al., 1994), liek domāt, ka parazīts vispirms nonāca no Meksikas uz Ziemeļameriku, kur tas izplatījās ar kultūraugiem, un pēc tam tika nogādāts uz Rietumeiropu (7. attēls).
Atkārtotas dreifēšanas (dubultās "pudeļu kakla" ietekmes) rezultātā Eiropā nonāca atsevišķi kloni, kuru pēcnācēji visā Vecās pasaules teritorijā, kur audzē kartupeļus, izraisīja pandēmiju. Kā pierādījumu šai hipotēzei autori min, pirmkārt, visur sastopamo tikai viena veida pārošanos (A1) un, otrkārt, dažādu reģionu pētīto celmu genotipu viendabīgumu (visu to pamatā ir molekulārie marķieri, ieskaitot 2 izozīmu lokusus, DNS pirkstu nospiedumu veidus un mitohondriju DNS struktūra ir identiska un atbilst ASV aprakstītajam US-1 klonam). Tomēr daži dati rada šaubas par vismaz dažiem izvirzītās hipotēzes nosacījumiem. Analīze P. infestans mitohondriju DNS, kas izdalīta no herbārijas kartupeļu paraugiem, kas inficēti pirmajā epifitotiskajā periodā 40. gados, parādīja, ka tie atšķiras pēc mitohondriju DNS struktūras no klona US-1, kas tāpēc bija vismaz nav vienīgais infekcijas avots Eiropā (Ristaino et al, 2001).
Vēlā saslimšanas situācija atkal pasliktinājās XX gadsimta 80. gados. Notikušas šādas izmaiņas:
1) Iedzīvotāju vidējā agresivitāte ir palielinājusies, kas jo īpaši ir novedis pie visizplatītākās vēlīnās iedegas formas - kāpostu un kātu bojājuma.
2) Kartupeļu novēlotās slimības laikā notika pāreja - no jūlija beigām līdz jūlija sākumam un pat līdz jūnija beigām.
3) A2 pārošanās tips, kura iepriekš nebija vecajā pasaulē, ir kļuvis visuresošs.
Pirms izmaiņām notika divi notikumi: masveida jaunā fungicīda metalaksila izmantošana (Schwinn and Staub, 1980) un Meksikas parādīšanās kā kartupeļu eksportētāja pasaulē (Niederhauser, 1993). Saskaņā ar to tika izvirzīti divi iemesli populācijas izmaiņām: pārošanās veida pārveidošana metalaksila ietekmē (Ko, 1994) un masveida jaunu celmu ieviešana ar inficētiem bumbuļiem no Meksikas (Fry un Goodwin, 1995). Kaut arī pārošanās veidu pārrēķinus metalaksila ietekmē ieguva ne tikai Ko, bet arī Maskavas Valsts universitātes laboratorijā veiktie darbi (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), vēlama ir otrā hipotēze. Līdz ar otrā pārošanās veida parādīšanos nopietnas izmaiņas notika krievu P. infestans celmu genotipos, tostarp neitrālos gēnos (izozīmu un RFLP lokusos), kā arī mitohondriju DNS struktūrā. Šo izmaiņu kompleksu nevar izskaidrot ar metalaksila darbību, drīzāk no Meksikas notika masveida jaunu celmu imports, kas, būdami agresīvāki (Kato et al., 1997), pārvietoja vecos celmus (US-1), kļūstot par dominējošiem populācijās. Eiropas populācijas sastāva izmaiņas notika ļoti īsā laikā - no 1980. līdz 1985. gadam (Fry et al., 1992). Bijušās PSRS teritorijā “jauni celmi” tika atrasti kolekcijās no Igaunijas 1985. gadā, tas ir, agrāk nekā Polijā un Vācijā (Goodwin et al., 1994). Pēdējo reizi "vecais celms US-1" Krievijā no inficēta tomāta Maskavas apgabalā tika izolēts 1993. gadā (Dolgova et al., 1997). Arī Francijā “vecie” celmi tomātu stādījumos tika atrasti līdz 90. gadu sākumam, tas ir, pēc tam, kad tie jau sen bija pazuduši uz kartupeļiem (Leberton and Andrivon, 1998). Izmaiņas P. infestans celmos ietekmēja daudzas pazīmes, ieskaitot tās, kurām ir liela praktiska nozīme, un palielināja vēlīnās pūtes kaitīgumu.
Seksuālā rekombinācija
Lai seksuālā rekombinācija veicinātu mainīgumu, ir nepieciešams, pirmkārt, divu veidu pārošanās klātbūtne populācijā proporcijā, kas ir tuvu 1: 1, un, otrkārt, sākotnējā populācijas mainīguma klātbūtne.
Pārošanās veidu attiecība dažādās populācijās un pat dažādos gados vienā populācijā ir ļoti atšķirīga (9,10., 90. tabula). Cēloņi šādām krasām pārošanās veidu biežuma izmaiņām populācijās (kā, piemēram, Krievijā vai Izraēlā pagājušā gadsimta 2002. gadu sākumā) nav zināmi, taču tiek uzskatīts, ka tas ir saistīts ar konkurētspējīgāku klonu ieviešanu (Cohen, XNUMX).
Daži netieši dati norāda uz seksuālā procesa gaitu noteiktos gados un noteiktos reģionos:
1) Maskavas apgabala populāciju pētījumi parādīja, ka 13 populācijās, kurās A2 pārošanās veida īpatsvars bija mazāks par 10%, trim izozīmu lokusiem aprēķinātā kopējā ģenētiskā daudzveidība bija 0,08 un 14 populācijās, kurās A2 daļa pārsniedza 30%, ģenētiskā daudzveidība bija divreiz augstāka (0,15) (Elansky et al., 1999). Tādējādi, jo lielāka ir dzimumakta varbūtība, jo lielāka ir iedzīvotāju ģenētiskā daudzveidība.
2) Attiecība starp pārošanās veidu attiecību populācijās un oosporu veidošanās intensitāti tika novērota Izraēlā (Cohen et al., 1997) un Holandē
(Flier et al., 2004). Mūsu pētījumi parādīja, ka populācijās, kurās izolāti ar A2 pārošanās veidu veidoja 62, 17, 9 un 6%, oosporas tika konstatētas attiecīgi 78, 50, 30 un 15% analizēto kartupeļu lapu (ar 2 vai vairāk plankumiem).
Paraugos ar 2 vai vairāk plankumiem daudz biežāk bija oosporas nekā paraugos ar 1 plankumu (attiecīgi 32 un 14% paraugu) (Apryshko et al., 2004).
Oosporas daudz biežāk bija sastopamas kartupeļu auga vidējā un apakšējā slāņa lapās (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) Dažos reģionos ir atklāti unikāli genotipi, kuru rašanās ir saistīta ar seksuālo rekombināciju. Tādējādi Polijā 1989. gadā un Francijā 1990. gadā glikozes-6-
fosfāta izomerāze (GPI 90/90). Tā kā iepriekš 10 gadus bija sastopamas tikai 90/100 heterozigotas, homozigotitāte tiek attiecināta uz seksuālo rekombināciju (Sujkowski et al., 1994). Kolumbijā (ASV) izplatīti ir izolāti, kas apvieno A2 ar GPI 100/110 un A1 ar GPI 100/100, tomēr 1994. gada sezonas beigās (16. augustā un 9. septembrī) celmi ar rekombinantiem genotipiem (A1 GPI 100/110 un A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) Dažās Polijas (Sujkowski et al., 1994) un Ziemeļkaukāza (Amatkhanova et al., 2004) populācijās pirkstu nospiedumu DNS lokusu un alozīmu proteīnu lokusu sadalījums atbilst Hardija-Veinberga izplatībai, kas
par lielo seksuālās rekombinācijas ieguldījumu īpatsvaru iedzīvotāju mainībā. Citos Krievijas reģionos netika atrasta atbilstība Hardija-Veinberga izplatībai populācijās, bet tika parādīta saiknes līdzsvara trūkums, kas norāda uz klonālās reprodukcijas pārsvaru (Elansky et al., 1999).
5) Ģenētiskā daudzveidība (GST) starp celmiem ar dažādiem pārošanās veidiem (A1 un A2) bija mazāka nekā starp dažādām populācijām (Sujkowski et al., 1994), kas netieši norāda uz seksuāliem krustojumiem.
Tajā pašā laikā seksuālās rekombinācijas ieguldījums iedzīvotāju daudzveidībā nevar būt ļoti liels. Šis ieguldījums tika aprēķināts Maskavas apgabala populācijām (Elansky et al., 1999). Saskaņā ar Levontina (1979) aprēķiniem "rekombinācija, kas var radīt jaunus variantus no diviem lokusiem ar frekvenci, kas nepārsniedz to heterozigotumu reizinājumu, kļūst efektīva tikai tad, ja heterozigotitātes vērtības abām alēlēm jau ir augstas".
Tā kā abu pāru veidu attiecība, kas raksturīga Maskavas reģionam, ir vienāda ar 4: 1, rekombinācijas biežums būs 0,25. Varbūtība, ka šķērsotie celmi būs heterozigoti diviem no trim pētītajiem izozīmu lokusiem pētītajās populācijās, bija 0,01 (2 celmi no 177). Līdz ar to dubulto heterozigotu rašanās varbūtībai rekombinācijas rezultātā nevajadzētu pārsniegt to reizinājumu ar reizināšanas varbūtību (0,25x0,02x0,02) = 10-4, t.i. seksuālie rekombinanti parasti neietilpst pētītajā celmu izlasē. Šie aprēķini tika veikti populācijām no Maskavas apgabala, kam raksturīga salīdzinoši liela mainība. Monomorfās populācijās, piemēram, Sibīrijas, seksuālais process, pat ja tas notiek atsevišķās populācijās, nevar ietekmēt to ģenētisko daudzveidību.
Turklāt P. infestans raksturo bieža hromosomu novirze mejozē, kas noved pie aneuploīdijas (Carter et al., 1999). Šādi traucējumi samazina hibrīdu auglību.
Parasexual rekombinācija, mitotisko gēnu pārveidošana
Eksperimentos ar P. infestans celmu saplūšanu ar rezistences mutācijām pret dažādiem augšanas inhibitoriem tika konstatēta pret abiem inhibitoriem rezistentu misolātu parādīšanās (Shattock and Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Celmi, kas izturīgi pret diviem augšanas inhibitoriem, radās micēlija heterokariotizācijas rezultātā, un šajā gadījumā tie sašķēlās reprodukcijas laikā ar vienkodolu zoosporām (Judelson, Ge Yang, 1998) vai nesadalījās monozoosporozos pēcnācējos, jo viņiem bija tetraploīdi (jo sākotnējie izolāti ir diploīdi) , 1979). Heterozigoti diploīdi ļoti zemā frekvencē atdalījās haploidizācijas, hromosomu nesadalīšanās un mitotiskas šķērsošanas dēļ (Poedinok et al., 1982). Šo procesu biežumu varētu palielināt, izmantojot noteiktu ietekmi uz heterozigotiem diploīdiem (piemēram, dīgtspējīgu sporu apstarošana ar UV starojumu).
Lai gan veģetatīvo hibrīdu veidošanās ar dubultu rezistenci notiek ne tikai in vitro, bet arī kartupeļu bumbuļos, kas inficēti ar mutantu maisījumu (Kulish et al., 1978), ir diezgan grūti novērtēt parasexual rekombinācijas lomu jaunu genotipu veidošanā populācijās. Segregantu veidošanās biežums haploidizācijas, hromosomu nesadalīšanās un mitotiskas šķērsošanas dēļ bez īpašiem efektiem ir nenozīmīgs (mazāks par 10-3).
Heterozigotu celmu homozigotu segregantu parādīšanās var būt balstīta gan uz mitotisko šķērsošanu, gan uz mitotisko gēnu pārvēršanu, kas P. sojae gadījumā notiek ar biežumu 3 x 10-2 līdz 5 x 10-5 vienā lokusā, atkarībā no celma (Chamnanpunt et al. , 2001).
Lai gan heterokarionu un heterozigotu diploīdu sastopamības biežums izrādījās negaidīti augsts (sasniedzot desmitiem procentu), šis process notiek tikai tad, kad tiek sasaistītas mutantu kultūras, kas iegūtas no tā paša celma. Izmantojot dažādus no dabas izolētus celmus, heterokariotizācija nenotiek (vai notiek ar ļoti zemu frekvenci) veģetatīvās nesaderības klātbūtnes dēļ (Poedinok un Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). Līdz ar to parasexual rekombinācijas lomu var samazināt tikai līdz intraklonālai rekombinācijai heterozigotu kodolos un atsevišķu gēnu pārejai uz homozigotu stāvokli bez dzimumprocesa. Šim procesam var būt epidemioloģiska nozīme celmos ar recesīvām vai daļēji dominējošām fungicīdu rezistences mutācijām. Tās pāreja uz homozigotu stāvokli parasexual procesa dēļ palielinās mutācijas nesēja pretestību (Dolgova, Dyakov, 1986).
Gēnu introgresija
Heterothallic sugas Phytophthora spēj krustoties ar hibrīdu oosporu veidošanos (skat. Vorobjeva un Gridņevs, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). Divu Phytophthora sugu dabiskais hibrīds bija tik agresīvs, ka Lielbritānijā nogalināja tūkstošiem alkšņu (Brasier et al., 1999). P. infestans var rasties ar citām ģints sugām (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum utt.) Uz kopīgiem saimniekaugiem un augsnē, taču literatūrā ir maz informācijas par starpsugu hibrīdu iespējamību. Laboratorijas apstākļos tika iegūti hibrīdi starp P. infestans un P. Mirabilis (Goodwin and Fry, 1994).
9. tabula. P. infestans celmu ar A2 pārošanās veidu īpatsvars dažādās pasaules valstīs laika posmā no 1990. līdz 2000. gadam (pēc atvērto literatūras avotu un vietņu www.euroblight.net, www.eucablight.org datiem)
Valsts | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Baltkrievija | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Beļģija | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ekvadora | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Igaunija | 8 (12) | ||||||||||
Anglija | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Somija | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Francija | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Ungārija | 72 (32) | ||||||||||
Īrija | 4 (145) | ||||||||||
Uz ziemeļiem. Īrija | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Nīderlande | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Norvēģija | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peru | 0 (34, 1984 - 86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Polija | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Skotija | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Zviedrija | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Velsa | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Korea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Ķīna | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Kolumbija | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Urugvaja | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Maroka | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Meksika (Toluka) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
10. tabula. P. infestans celmu ar A2 pārošanās veidu īpatsvars dažādās pasaules valstīs laika posmā no 2000. līdz 2011. gadam
Valsts | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Austrija | 65 (83) | ||||||||||
Baltkrievija | 42 (78) | ||||||||||
Beļģija | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Šveice | 89 (19) | ||||||||||
Čehija | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Vācija | 95 (53) | ||||||||||
Dānija | 48 (52) | ||||||||||
Ekvadora | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Igaunija | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Anglija | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Somija | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Francija | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Ungārija | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Uz ziemeļiem. Īrija | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Nīderlande | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Norvēģija | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peru | 0 (36) | ||||||||||
Polija | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Skotija | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Zviedrija | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slovākija | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Velsa | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Korea | 46 (26) | ||||||||||
Brazīlija | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Ķīna | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vjetnama | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Populāciju genotipiskā sastāva dinamika
Izmaiņas P. infestans populācijas genotipiskajā sastāvā var notikt jaunu klonu migrācijas no citiem reģioniem, lauksaimniecības prakses (šķirņu maiņa, fungicīdu lietošana) un laika apstākļu ietekmē. Ārējās ietekmes klonus dažādos dzīves cikla posmos ietekmē atšķirīgi, tāpēc populācijās ik gadu notiek cikliskas izmaiņas atlasāmo gēnu frekvencēs, mainoties gēnu novirzes un atlases dominējošajai lomai.
Šķirnes ietekme
Jaunas šķirnes ar efektīviem vertikālās rezistences gēniem (R-gēni) ir spēcīgs selektīvs faktors, P. infestans populācijās atlasot klonus ar komplementāriem virulences gēniem. Tā kā kartupeļu šķirnei nav nespecifiskas rezistences, kas kavē patogēnu populācijas augšanu, populācijā dominējošo klonu aizstāšanas process notiek ļoti ātri. Tādējādi pēc izplatības Maskavas apgabalā Domodedovsky šķirnei, kurai ir R3 rezistences gēns, šīs šķirnes virulentu klonu biežums viena gada laikā palielinājās no 0,2 līdz 0,82 (Dyakov and Derevjagina, 2000).
Tomēr virulences gēnu (patotipu) biežuma izmaiņas populācijās notiek ne tikai kultivētu kartupeļu šķirņu ietekmē. Piemēram, Baltkrievijā līdz 1977. gadam dominēja kloni ar 1. un 4. virulences gēnu, ko izraisīja kartupeļu šķirņu audzēšana ar rezistences gēniem R1 un R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Tomēr 70. gadsimta 2002. gadu beigās kloni parādījās ar dažādiem virulences gēniem un to kombinācijām, un komplementāros rezistences gēnus nekad neizmantoja kartupeļu selekcijā (papildus virulences gēni) (Ivanyuk et al., XNUMX). Šādu klonu parādīšanās iemesls acīmredzot ir saistīts ar infekciozā materiāla migrāciju uz Eiropu no Meksikas ar kartupeļu bumbuļiem. Mājās šie kloni attīstījās ne tikai uz kultivētiem kartupeļiem, bet arī uz savvaļas sugām, kurām bija dažādi rezistences gēni, tāpēc izdzīvošanai šajos apstākļos bija nepieciešama daudzu virulences gēnu kombinācija genomā.
Kas attiecas uz šķirnēm ar nespecifisku rezistenci, tās, samazinot patogēna reprodukcijas ātrumu, aizkavē tā populāciju attīstību, kas, kā jau minēts, ir skaitļa funkcija. Tā kā agresivitāte ir poligeniska, kloni, kas satur lielāku "agresivitātes" gēnu skaitu, uzkrājas jo ātrāk, jo lielāks ir populācijas lielums. Tāpēc ļoti agresīvas sacīkstes nav adaptācijas produkts kultivētajām šķirnēm ar nespecifisku pretestību, bet, gluži pretēji, tās biežāk tiek atklātas ļoti uzņēmīgu šķirņu stādījumos, kas ir parazītu sporu akumulatori.
Tādējādi Krievijā agresīvākās P. Infestans populācijas tika konstatētas ikgadējo epifitotu zonās (Sahalīnas, Ļeņingradas un Brjanskas apgabalu populācijas). Šo iedzīvotāju agresivitāte izrādījās augstāka nekā meksikāņu (Filippov et al., 2004).
Turklāt izturīgo šķirņu lapās veidojas mazāk oosporu nekā uzņēmīgajās (Hanson and Shattock, 1998), tas ir, šķirnes nespecifiskā pretestība samazina arī parazītu rekombinācijas spējas un alternatīvu ziemošanas metožu iespēju.
Fungicīdu ietekme
Fungicīdi ne tikai samazina fitopatogēno sēņu skaitu, t.i. ietekmē to populāciju kvantitatīvās īpašības, taču tās var mainīt arī atsevišķu genotipu biežumu, t.i. ietekmēt populāciju kvalitatīvo sastāvu. Starp svarīgākajiem populāciju rādītājiem, kas mainās fungicīdu ietekmē, ir šādi: rezistences izmaiņas pret fungicīdiem, agresivitātes un virulences izmaiņas, kā arī reproduktīvās sistēmas izmaiņas.
Fungicīdu ietekme uz populāciju rezistenci un agresivitāti
Šīs ietekmes pakāpi vispirms nosaka izmantotā fungicīda veids, kuru nosacīti var iedalīt polisitā, oligosītā un monosītā.
Pirmais ietver lielāko daļu kontaktfungicīdu. Izturību pret viņiem (ja tas vispār ir iespējams) kontrolē liels skaits ļoti vāji izteiksmīgu gēnu. Šīs īpašības nosaka, ka pēc apstrādes ar fungicīdiem nav redzamu populācijas rezistences izmaiņu (lai gan dažos eksperimentos tika panākts zināms rezistences pieaugums). Sēņu populācija, kas saglabājusies pēc izsmidzināšanas ar kontaktfungicīdiem, sastāv no divām celmu grupām:
1) Celmi, kas saglabāti augu vietās, kuras nav ārstētas ar šo narkotiku. Tā kā nebija kontakta ar fungicīdu, šo celmu agresivitāte un izturība nemainās.
2) Celmi saskarē ar fungicīdu, kura koncentrācija saskares punktos bija zem letāla. Kā jau minēts iepriekš, arī šīs populācijas daļas pretestība nemainās, tomēr fungicīda daļējas bojājošās iedarbības dēļ pat subletālā koncentrācijā uz sēnīšu šūnas metabolismu, vispārējo piemērotību un tā parazītisko komponentu, agresivitāti, samazinās (Derevyagina and Dyakov, 1990).
Tādējādi pat daļai populācijas, kas nav mirusi, nonākot saskarē ar fungicīdu, ir vāja agresivitāte un tā nevar būt epifītiķu avots. Tāpēc rūpīga apstrāde, kas samazina to iedzīvotāju īpatsvaru, kuri nesaskaras ar fungicīdu, ir nosacījums, lai panāktu aizsardzības pasākumus. Izturību pret oligosīta fungicīdiem kontrolē vairāki piedevu gēni.
Katra gēna mutācija nedaudz palielina rezistenci, un vispārējā rezistences pakāpe ir saistīta ar šādu mutāciju pievienošanu. Tāpēc pretestības palielināšanās notiek pakāpeniski. Piemēri pakāpeniskam rezistences pieaugumam ir rezistences mutācijas pret fungicīdu dimethomorph, ko plaši izmanto, lai pasargātu kartupeļus no vēlīnām pūtēm. Dimethomorph pretestība ir poligēna un piedeva. Vienpakāpes mutācija nedaudz palielina pretestību.
Katra nākamā mutācija samazina mērķa lielumu un līdz ar to nākamo mutāciju biežumu (Bagirova et al., 2001). Populācijas vidējās rezistences pieaugums pēc atkārtotām apstrādēm ar oligosīta fungicīdu notiek pakāpeniski un pakāpeniski. Šī procesa ātrumu nosaka vismaz trīs faktori: rezistences gēnu mutāciju biežums, rezistences koeficients (rezistenta celma letālās devas attiecība pret jutīgo) un rezistences gēnu mutāciju ietekme uz piemērotību.
Katras nākamās mutācijas sastopamības biežums ir mazāks nekā iepriekšējais, tāpēc procesam ir amortizējošs raksturs (Bagirova et al., 2001). Tomēr, ja populācijā notiek rekombinācijas procesi (seksuāli vai parasexual), tad hibrīdā celmā ir iespējams apvienot dažādas vecāku mutācijas un paātrināt procesu. Tāpēc panmix populācijas pretestību iegūst ātrāk nekā agamiskās, un pēdējās populācijas, kurām nav veģetatīvās nesaderības barjeru, ātrāk nekā populācijas, kas dalītas ar šādām barjerām. Šajā sakarā celmu klātbūtne populācijās, kas atšķiras pēc pārošanās veidiem, paātrina rezistences iegūšanas procesu pret oligosīta fungicīdiem.
Otrais un trešais faktors neveicina ātru dimetomorfam rezistentu celmu uzkrāšanos populācijās. Katra nākamā mutācija aptuveni divkāršo pretestību, kas ir nenozīmīga, un tajā pašā laikā samazina gan augšanas ātrumu mākslīgā vidē, gan agresivitāti (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Varbūt tāpēc dabisko P. infestans celmu vidū praktiski nav izturīgu celmu, pat tādu, kas savākti no kartupeļu stādījumiem, kas apstrādāti ar dimetomorfu.
Ar oligosīta fungicīdu ārstēta populācija sastāvēs arī no divām celmu grupām: tām, kuras nav bijušas saskarē ar fungicīdu un tāpēc nav mainījušas sākotnējās iezīmes (ja šajā grupā tiek atrasti rezistenti celmi, tie neuzkrāsies jutīgu celmu augstākas agresivitātes un konkurētspējas dēļ), un celmi, kas nonāk saskarē ar fungicīda subletālo koncentrāciju. Starp pēdējiem ir iespējama rezistentu celmu uzkrāšanās, jo šeit viņiem ir priekšrocības salīdzinājumā ar jutīgiem.
Tāpēc, lietojot oligosīta fungicīdus, svarīga ir ne tik rūpīga apstrāde, cik augsta zāļu koncentrācija, vairākas reizes lielāka par letālo devu, jo ar pakāpenisku mutagenēzi mutācijas celmu sākotnējā rezistence ir zema.
Visbeidzot, rezistences pret monozītu fungicīdiem mutācijas ir ļoti izteiksmīgas, tas ir, viena mutācija var liecināt par augstu rezistences līmeni līdz pilnīgai jutīguma zudumam. Tāpēc populāciju pretestības pieaugums notiek ļoti ātri.
Šādu fungicīdu piemērs ir fenilamīdi, ieskaitot visbiežāk sastopamo fungicīdu metalaksilu. Izturības pret to mutācijas rodas ar lielu frekvenci, un rezistences pakāpe mutantos ir ļoti augsta - tā pārsniedz jutīgo celmu ar tūkstoša vai lielāka koeficientu (Derevyagina et al., 1993). Lai gan rezistentu mutantu augšanas ātrums un agresivitāte samazinās, ņemot vērā uzņēmīgo celmu nāvi no sistēmiskā fungicīda, rezistentu populācijas skaits strauji pieaug, un tās agresivitāte palielinās paralēli. Tāpēc pēc vairākiem fungicīda lietošanas gadiem rezistentu celmu agresivitāte var ne tikai pielīdzināt jutīgo agresivitāti, bet arī pārsniegt to (Derevyagina, Dyakov, 1992).
Ietekme uz seksuālo rekombināciju
Tā kā A2 pārošanās veida bieža parādīšanās P. infestans populācijās sakrita ar metalaksila intensīvu lietošanu pret vēlu puvi, tika ieteikts, ka metalaksils izraisa pārošanās veida pārveidošanos. P. parasitica eksperimentāli tika pierādīta šāda pārveidošanās hloroneta un metalaksila iedarbībā (Ko, 1994). Viena pāreja uz barotnes ar zemu metalaksila koncentrāciju noveda pie homotalāma izolātu parādīšanās no P. infestans celma, kas ir jutīgs pret metalaksilu ar A1 pārošanās veidu (Savenkova un Cherepnikova-Anikina, 2002). Turpmāko pāreju laikā uz barotnēm ar lielāku metalaksila koncentrāciju netika konstatēts neviens A2 pārošanās veida izolāts, tomēr lielākā daļa izolātu, šķērsojot ar A2 izolātiem, nevis oosporas, veidoja neglītu micēlija uzkrāšanos un bija sterili. Rezistenta A2 pārošanās tipa celma pārejas uz barotnēm ar augstu metalaksila koncentrāciju ļāva mums atklāt trīs pārošanās veida izmaiņu formas: 1) pilnīga sterilitāte, šķērsojot A1 un A2 izolātus; 2) homotālisms (oosporu veidošanās monokultūrā); 3) A2 pārošanās veida pārveidošana par A1. Tādējādi metalaksils var izraisīt izmaiņas pārošanās veidos P. infestans populācijās un līdz ar to arī seksuālās rekombinācijas rašanos tajās.
Ietekme uz veģetatīvo rekombināciju
Daži antibiotiku rezistences gēni palielināja hifālās heterokariotizācijas un kodola diploidizācijas biežumu (Poedinok un Dyakov, 1981). Kā minēts iepriekš, hifu heterokariotizācija dažādu P. infestans celmu saplūšanas laikā notiek ļoti reti, pateicoties veģetatīvās nesaderības parādībai šajā sēnītē. Tomēr dažu antibiotiku rezistences gēniem var būt blakusparādības, kas izteiktas veģetatīvās nesaderības pārvarēšanā. Šai īpašībai bija 1S-1 mutanta streptomicīna rezistences gēns. Šādu mutantu klātbūtne fitoftoras lauka populācijās var palielināt gēnu plūsmu starp celmiem un paātrināt visas populācijas pielāgošanos jaunām šķirnēm vai fungicīdiem.
Daži fungicīdi un antibiotikas var ietekmēt mitotiskās rekombinācijas biežumu, kas arī var mainīt genotipa biežumu populācijās. Plaši lietotais fungicīds benomils saistās ar beta-tubulīnu - olbaltumvielu, no kuras tiek uzbūvēti citoskeleta mikrotubulīši, un tādējādi tiek izjaukti hromosomu atdalīšanas procesi mitozes anafāzē, palielinot mitotiskās rekombinācijas biežumu (Hastie, 1970).
Fungicīdam para-fluorfenilalanīnam, ko lieto holandiešu slimības ārstēšanai gobās, ir tāda pati īpašība. Parafluorfenilalanīns palielināja rekombinācijas biežumu heterozigotiskajos diploīdos P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Cikliskas izmaiņas populāciju genotipiskajā sastāvā P. infestans dzīves ciklā
P. infestans klasiskais attīstības cikls mērenajā zonā sastāv no 4 fāzēm.
1) Eksponenciālas populācijas pieauguma fāze (policikliskā fāze) ar īsām paaudzēm. Šī fāze parasti sākas jūlijā un ilgst 1,5-2 mēnešus.
2) Iedzīvotāju pieauguma apturēšanas fāze sakarā ar strauju neietekmētu audu īpatsvara samazināšanos vai nelabvēlīgu laika apstākļu iestāšanos. Šis posms saimniecībās, kas veic agrīnu lapu novākšanu pirms ražas novākšanas, izstājas no gada cikla.
3) ziemošanas fāze bumbuļos, ko papildina ievērojams populācijas lieluma samazinājums nejaušas bumbuļu infekcijas dēļ, lēna infekcijas attīstība tajos, bumbuļu atkārtotas inficēšanās neesamība, skarto bumbuļu puve un iznīcināšana normālos uzglabāšanas apstākļos.
4) Lēnas attīstības fāze augsnē un uz stādiem (monocikliskā fāze), kurā radīšanas ilgums var sasniegt mēnesi vai vairāk (maija beigās - jūlija sākumā). Parasti šajā laikā slimības lapas ir grūti atklāt pat ar īpašiem novērojumiem.
Eksponenciālas populācijas pieauguma fāze (policikliskā fāze)
Daudzi novērojumi (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Ošs, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) parādīja, ka epifitotijas sākumā dominē mazvirulenti un nedaudz agresīvi kloni, kurus vēlāk aizstāj ar virulentākiem un agresīvākiem. populācijas agresivitātes pieauguma temps ir lielāks, jo mazāk izturīga saimniekauga šķirne.
Pieaugot populācijai, palielinās gan selektīvi svarīgu gēnu, kas ievesti komerciālās šķirnēs (R1-R4), gan selektīvi neitrālu (R5-R11), koncentrācija. Tātad populācijās pie Maskavas 1993. gadā vidējā virulence no jūlija beigām līdz augusta vidum pieauga no 8,2 līdz 9,4, un vislielākais pieaugums tika novērots selektīvi neitrālajam virulences gēnam R5 (no 31 līdz 86% virulentu klonu) (Smirnov, 1996 ).
Iedzīvotāju skaita pieauguma tempa samazināšanos pavada iedzīvotāju parazitārās aktivitātes samazināšanās. Tāpēc depresīvos gados gan kopējais braucienu skaits, gan ļoti virulentu sacīkšu īpatsvars ir mazāks nekā epifitotiskajos (Borisenok, 1969). Ja epifitotisko apstākļu laikā laika apstākļi mainās uz nelabvēlīgu vēlīnai pūtītei un samazinās kartupeļu invāzija, samazinās arī ļoti virulentu un agresīvu klonu koncentrācija (Rybakova et al., 1987).
Gēnu biežuma pieaugums, kas ietekmē populācijas virulenci un agresivitāti, var būt saistīts ar virulentāku un agresīvāku klonu izvēli jauktajā populācijā. Atlases demonstrēšanai tika izstrādāta metode neitrālu mutāciju analīzei, kuru veiksmīgi izmantoja rauga (Adams et al., 1985) un Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995) ķīmisko vielu populācijās.
Pret blasticidīnu S rezistentu mutantu biežums P. infestans lauka populācijā samazinājās paralēli populācijas agresivitātes pieaugumam, kas norāda uz dominējošo klonu izmaiņām populācijas pieauguma laikā (Rybakova et al., 1987).
Ziemošanas fāze bumbuļos
Ziemošanas laikā kartupeļu bumbuļos P. infestans celmu virulence un agresivitāte samazinās, un virulences samazināšanās notiek lēnāk nekā agresivitāte (Rybakova un Dyakov, 1990). Acīmredzot apstākļos, kas veicina populācijas lieluma strauju pieaugumu (r-selekcija), ir noderīgi "ekstra" virulences gēni un augsta agresivitāte, tāpēc epifitotiku attīstību papildina virulentāko un agresīvāko klonu atlase. Vides piesātinājuma apstākļos, kad svarīga loma ir nevis reprodukcijas ātrumam, bet gan pastāvēšanas pastāvēšanai nelabvēlīgos apstākļos (K-selekcija), "papildu" virulences un agresivitātes gēni samazina fizisko sagatavotību, un kloni ar šiem gēniem ir pirmie, kas izmirst, tāpēc vidējā agresivitāte un iedzīvotāju virulence samazinās.
Veģetācijas fāze augsnē
Šī fāze ir visnoslēpumainākā dzīves ciklā (Andrivon, 1995). Tās esamība tika postulēta tīri spekulatīvi - informācijas trūkuma dēļ par to, kas notiek ar patogēnu ilgākā laika posmā (dažreiz vairāk nekā mēnesi) - no kartupeļu stādu parādīšanās līdz pirmo slimības plankumu parādīšanās uz tiem. Pamatojoties uz novērojumiem un eksperimentiem, tika atjaunota sēnītes uzvedība šajā dzīves periodā (Hirst un Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Sēnes sporulācija var veidoties uz inficētiem bumbuļiem augsnē. Iegūtās sporas dīgst ar hifām, kuras augsnē var ilgstoši veģetēt. Primārās (veidojas uz bumbuļiem) un sekundārās (uz augsnē esošā micēlija) sporas līdz kapilāru straumēm paceļas uz augsnes virsmu, bet spēju inficēt kartupeļus iegūst tikai pēc tam, kad tās apakšējās lapas nolaižas un saskaras ar augsnes virsmu. Šādas lapas (proti, uz tām atrodami pirmie slimības plankumi) neveidojas uzreiz, bet pēc ilgstošas kartupeļu virsotņu augšanas un attīstības.
Tādējādi saprotrofiskās veģetācijas fāze var pastāvēt arī P. infestans dzīves ciklā. Ja dzīves cikla parazitārajā fāzē agresivitāte ir vissvarīgākā fitnesa sastāvdaļa, tad saprotrofiskajā fāzē atlase ir vērsta uz parazitāro īpašību mazināšanu, kā tas eksperimentāli tika parādīts dažām fitopatogēnām sēnēm (skat. Carson, 1993). Tāpēc šajā cikla posmā agresīvākās īpašības būtu jāzaudē visintensīvāk. Bet līdz šim nav veikti tiešie eksperimenti, lai apstiprinātu iepriekš minētos pieņēmumus.
Sezonas izmaiņas ietekmē ne tikai P. infestans patogēnās īpašības, bet arī izturību pret fungicīdiem, kas aug policikliskajā fāzē (epifitoties laikā) un samazinās ziemas glabāšanas laikā (Derevyagina et al., 1991; Kadish and Cohen, 1992). Īpaši intensīvs rezistences pret metalaksilu kritums tika novērots laika posmā starp skarto bumbuļu stādīšanu un pirmo slimības plankumu parādīšanos laukā.
Intraspecifiskā specializācija un tās attīstība
P. infestans izraisa epidēmijas divās komerciāli nozīmīgās kultūrās - kartupeļos un tomātos. Epifītijas uz kartupeļiem sākās drīz pēc tam, kad sēne ienāca jaunās platībās. Tomātu sakāve tika atzīmēta arī neilgi pēc infekcijas parādīšanās uz kartupeļiem, bet epifitoties uz tomātiem - tikai simts gadus vēlāk - XNUMX. gadsimta vidū. Lūk, ko Hallegli un Nīderhauzers raksta par tomātu sakāvi ASV
(1962): “Aptuveni 100 gadus pēc smagā 1845. gada epitotozes maz vai gandrīz nemēģināja iegūt izturīgas tomātu šķirnes. Neskatoties uz to, ka novēlota pūtīte tomātiem pirmo reizi tika reģistrēta jau 1848. gadā, tā kļuva par šīs augu selekcionāru nopietnas uzmanības objektu tikai pēc spēcīga slimības uzliesmojuma 1946. gadā. Krievijas teritorijā vēlīnā tomātu pūtīte tika reģistrēta 60. gadsimtā. “Ilgu laiku pētnieki nepievērsa uzmanību šai slimībai, jo tā neradīja būtisku ekonomisku kaitējumu. Bet 70. un 1979. gados. XX gadsimta tomātu novēlotas pūtes epifīti ir novērojami Padomju Savienībā, galvenokārt Lejas Volgas reģionā, Ukrainā, Ziemeļkaukāzā, Moldovā ... ”(Balašova, XNUMX).
Kopš tā laika tomātu sērga ar vēlu puvi ir kļuvusi par ikgadēju, izplatījusies visā rūpnieciskās un mājas audzēšanas teritorijā un rada milzīgu ekonomisku kaitējumu šai kultūrai. Kas notika? Kāpēc parazīta pirmā parādīšanās uz kartupeļiem un šīs kultūras epifitotiskais bojājums notika gandrīz vienlaicīgi, un kāpēc pagāja gadsimts, lai epifitotika parādītos uz tomātiem? Šīs atšķirības atbalsta Meksikas, nevis Dienvidamerikas infekcijas avotu. Ja Phytophthora infestans suga veidojās kā Meksikas bumbuļus saturošo Solanum ģints sugu parazīts, tad ir saprotams, kāpēc tik spēcīgi tika ietekmēti kultivētie kartupeļi, kas pieder tai pašai ģints sadaļai kā Meksikas sugas, bet tāpēc, ka nebija parakvārijas, kurā neizveidojās specifiskas un nespecifiskas rezistences mehānismi.
Tomāts pieder citai ģints sadaļai, tā apmaiņas veidam ir būtiskas atšķirības no bumbuļu sugām, tāpēc, neskatoties uz to, ka tomāts neatrodas ārpus P. infestans pārtikas specializācijas, tā sakāves intensitāte nebija pietiekama, lai radītu nopietnus ekonomiskus zaudējumus.
Epifitoties parādīšanās uz tomāta ir saistīta ar nopietnām parazīta ģenētiskām izmaiņām, kas parazītisma laikā palielināja tā piemērotību (patogenitāti). Mēs uzskatām, ka jaunā forma, kas specializējas tomātu parazitēšanai, ir M. Gallegly aprakstītā T1 rase, kas ietekmē ķiršu tomātu (Red Cherry, Ottawa) šķirnes, kas ir izturīgas pret kartupeļos plaši izplatīto T0 rasi (Gallegly, 1952). Acīmredzot mutācija (vai mutāciju sērija), kas T0 sacīkstes pārvērta par T1 sacīkstēm un izraisīja klonu parādīšanos, kas ļoti pielāgoti tomātu uzvarēšanai. Kā tas bieži notiek, patogenitātes palielināšanās vienam saimniekam bija saistīta ar tā samazināšanos citam, tas ir, radās sākotnēja, vēl nepabeigta intraspecifiska specializācija - uz kartupeļiem (T0 rase) un uz tomātiem (T1 rase).
Kas liecina par šo pieņēmumu?
- Notiek uz kartupeļiem un tomātiem. Uz tomātu lapām dominē T1 skrējiens, savukārt kartupeļu lapās tas notiek reti. Pēc S.F.Bagirova un T.A. Orešonkova (nepublicēta) Maskavas apgabalā 1991.-1992. Gadā T1 skrējiena sastopamība kartupeļu stādījumos bija 0%, bet tomātu stādījumos - 100%; 1993.-1995. gadā - attiecīgi 33% un 90%; 2001. gadā - 0% un 67%. Līdzīgi dati tika iegūti Izraēlā (Cohen, 2002). Eksperimenti ar kartupeļu bumbuļu inficēšanu ar T1 rases izolātiem un T0 un T1 izolātu maisījumu parādīja, ka T1 rases izolāti bumbuļos ir slikti saglabājušies un tos aizstāj ar T0 rases izolātiem (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) T1 skrējiena dinamika tomātu stādījumos. Primāro tomātu lapu infekciju veic T0 rases izolāti, kas dominē, analizējot infekciju pirmajos plankumos, kas izveidojušies uz lapām. Tas apstiprina vispārpieņemto parazītu migrācijas shēmu: galveno kartupeļu inficēšanās masu veido T0 rase, tomēr neliels skaits T1 klonu, kas konservēti kartupeļos, vienreiz uz tomāta, izspiež T0 rasi un uzkrājas epifītiskā perioda beigās. Iespējams arī, ka ir alternatīvs tomātu lapu infekcijas avots ar T1 rasi, kas nav tik spēcīgs kā kartupeļu bumbuļi un lapas, bet nemainīgs. Tāpēc šim avotam ir vāja ietekme uz tomātu inficējošās populācijas ģenētisko struktūru, bet pēc tam tas nosaka T1 rases uzkrāšanos (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) Agresivitāte kartupeļiem un tomātiem. Mākslīga tomātu un kartupeļu lapu inficēšana ar T0 un T1 rases izolātiem parādīja, ka pirmie ir agresīvāki kartupeļiem nekā tomātiem, bet otrie agresīvāki tomātiem nekā kartupeļiem. Šīs atšķirības izpaužas ne “savas” rases izolātu pārvietošanā no jauktas populācijas lapām ejot siltumnīcā (Dyakov et al., 1975) un lauklaukumos (Leberton et al., 1999); minimālās infekcijas slodzes, latentuma perioda, infekcijas plankumu lieluma un sporu veidošanās atšķirības (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et et. al., 1999; Vega-Sanchez et al., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna et al., 2004).
T1 rases izolātu agresivitāte pret tomātu šķirnēm, kurām trūkst rezistences gēnu, ir tik augsta, ka šie izolāti sporas uz lapām, kā uz barības vielas, nekrotizējot inficētos audus (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) Virulence kartupeļiem un tomātiem. T1 rase ietekmē ķiršu tomātu šķirnes ar Ph1 rezistences gēnu, savukārt T0 rase nav spējīga inficēt šīs šķirnes, t.i. ir šaurāka virulence. Saistībā ar diferenciatoriem
Kartupeļu R-gēni ir apgriezti saistīti, t.i. no tomātu lapām izdalītie celmi ir mazāk virulenti nekā "kartupeļu" celmi (11. tabula).
5) Neitrālie marķieri. Neitrālu marķieru analīze P. infestans populācijās, kas parazitē uz kartupeļiem un tomātiem, liecina arī par daudzvirzienu intraspecifisko selekciju. Brazīlijas P. infestans populācijās tomātu lapu izolāti piederēja klonālajai līnijai US-1, bet kartupeļu lapu - BR-1 līnijai (Suassuna et al., 2004). Floridā (ASV) kopš 1994. gada kartupeļos sāka dominēt US-90 klons (sastopams vairāk nekā 8%), bet tomāti - US-11 un US-17, un pēdējā izolāti ir agresīvāki tomātiem nekā kartupeļiem (Weingartner , Tombolato, 2004). Nozīmīgas atšķirības genotipa frekvencēs (DNS pirkstu nospiedumos) kartupeļu un tomātu izolātos tika noteiktas 1200 P. infestans celmiem, kas savākti Amerikas Savienotajās Valstīs no 1989. līdz 1995. gadam (Deahl et al., 1995).
Izmantojot AFLP metodi, bija iespējams nošķirt 74 celmus, kas savākti no kartupeļu un tomātu lapām 1996.-1997. Francijā un Šveicē 7 grupās. Kartupeļu un tomātu celmi skaidri neatšķīrās, taču "kartupeļu" celmi bija ģenētiski daudzveidīgāki nekā "tomātu". Pirmie tika atrasti visās septiņās kopās, bet otrie - tikai četrās, kas norāda uz specializētāku otrā genomu (Knapova un Gisi, 2002).
6) Izolācijas mehānismi. Ja parazītu populācijas uz divām saimniekaugu sugām attīstās uz specializācijas sašaurināšanos līdz viņu pašu “saimniekam”, tad rodas dažādi pirms un postmeiotiski mehānismi, kas novērš starppopulācijas ģenētisko apmaiņu (Dyakov and Lekomtseva, 1984).
Vairākos pētījumos ir pētīta vecāku celmu avota ietekme uz hibridizācijas efektivitāti. Kad Ekvadorā tika krustoti celmi, kas izolēti no dažādām Solanum ģints sugām (Oliva et al., 2002), tika konstatēts, ka vissliktāk ar tomātu celmiem (EC līnija) šķērsoja celmi ar A2 pārošanās tipu no savvaļas nakteņu (klonālā līnija EC-2). -3) un visefektīvāk sakrustots ar kartupeļu celmu (EC-1).
Tika konstatēts, ka visi hibrīdi nav patogēni. Autori uzskata, ka mazais hibridizācijas un patogenitātes samazināšanās procents hibrīdos ir saistīts ar populāciju reproduktīvās izolācijas postmeiotiskajiem mehānismiem.
Bagirova et al. (1998) eksperimentos tika šķērsots liels skaits kartupeļu un tomātu celmu ar T0 un T1 rases īpašībām. Visauglīgākie T1xT1 celmu, kas izolēti no tomātiem, krustojumi (36 oosporas mikroskopa redzes laukā, 44% oosporu dīgtspējas), vismazāk efektīvi bija T0xT1 rases krustojumi, kas izolēti no dažādiem saimniekiem (mazs attīstītu un dīgstu oosporu skaits, liels abortīvu un nepietiekami attīstītu oosporu skaits) ... Krustojumu efektivitāte starp T0 rases izolātiem, kas izolēti no kartupeļiem, bija vidēja. Tā kā T0 rases galvenais celmu sastāvs ietekmē kartupeļus, tam ir uzticams ziemošanas avots - kartupeļu bumbuļi, kā rezultātā oosporu kā ziemojošo infekcijas vienību nozīme populācijām no kartupeļiem ir maza. Pielāgotā "tomātu forma" spēj ziemot uz tomāta oosporu veidā (skatīt zemāk), un tāpēc saglabā augstāku dzimumprocesa produktivitāti. Augstas auglības dēļ T1 iegūst neatkarīgu potenciālu primārajai infekcijai tomātos. Knapova et al. (Knapova et al., 2002) iegūtos rezultātus var interpretēt vienādi. No kartupeļiem izdalīto celmu krustojumi ar tomātu celmiem deva vislielāko oosporu skaitu - 13,8 uz kv.mm. barotne (ar 5–19 izplatību) un oosporu dīgtspējas starpprocents (6,3 ar 0–24 izplatību). Krustojot celmus, kas izolēti no tomātiem, tika iegūts viszemākais oosporu procentuālais daudzums (7,6 ar izplatību 4-12) ar visaugstāko to dīgtspēju (10,8). Krustojumos starp kartupeļiem izolētiem celmiem tika iegūts starpposma oosporu skaits (8,6 ar lielu datu izkliedi - 0-30) un zemākais oosporu dīgtspējas procents (2,7). Tādējādi kartupeļu celmi ir mazāk auglīgi nekā tomātu, bet interpopulācijas krustojumi nedeva sliktākus rezultātus nekā intrapopulācijas. Iespējams, ka atšķirības ar Bagirova et al. ir izskaidrojami ar to, ka krievu pētnieki strādāja ar celmiem, kas izolēti 90. gadsimta 90. gadu sākumā, un Šveices pētnieki - ar celmiem, kas izolēti XNUMX. gadu beigās.
Zemas auglības pamatā var būt celmu heteroploīdija. Ja Meksikas populācijās, kur dzimumprocess un primārā inficēšanās ar olšūnu pēcnācējiem ir regulāra, lielākā daļa pētīto P. Infestans celmu ir diploīdi, tad Vecās pasaules valstīs novēro plopijas polimorfismu (di-, tri- un tetraploīdus celmus, kā arī heterokariotu celmus ar heteroploīdiem kodoliem). un celmiem ar dažādu pārošanās veidu, t.i. savstarpēji auglīgi, atšķiras ar kodolploīdiju (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Anteridiju un oogoniju kodolu daudzveidība var būt zemas auglības cēlonis.
Kas attiecas uz kodolu apmaiņu starp hifām anastomozes laikā, to novērš veģetatīvā nesaderība, kas nesaistītās populācijas sadala daudzos ģenētiski izolētos klonos (Poedinok un Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) Populāciju konverģence. Iepriekš minētie dati norāda, ka ir iespējama hibridizācija starp "kartupeļu" un "tomātu" P. infestans celmiem. Iespējama arī savstarpēja dažādu saimnieku atkārtota inficēšanās, lai arī ar samazinātu agresivitāti.
Pētījums par populācijas marķieriem izolātos no blakus esošajiem kartupeļu un tomātu laukiem 1993. gadā parādīja, ka apmēram ceturtā daļa no tomātu lapām izolēto izolātu tika pārvietoti no kaimiņu kartupeļu lauka (Dolgova et al., 1997). Teorētiski varētu pieņemt, ka populāciju atšķirība starp diviem saimniekiem palielināsies un novedīs pie specializētu intraspecifisku formu (piemēram, kartupeļu un tomātu tomātu) parādīšanās, it īpaši tāpēc, ka oosporas var saglabāties augu atliekās (Drenth et al., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) un tomātu sēklas (Rubin et al., 2001). Līdz ar to tomātiem pašlaik ir pavasara atjaunošanās avots, kas nav atkarīgs no kartupeļu bumbuļiem.
Tomēr viss notika citādi. Pārziemošana ar oosporām ļāva parazītam izvairīties no šaurākā dzīves cikla posma - monocikliskās veģetācijas stadijas augsnē, kuras laikā samazinās parazitārās īpašības, kuras vasarā pakāpeniski atjaunojas policikliskajā fāzē.
11. tabula. Virulences gēnu biežums kartupeļu diferenciācijas šķirnēm P. infestans celmos
Valsts | Gads | Vidējais virulences gēnu skaits celmos | Autors | |
no kartupeļiem | no tomāta | |||
Francija | 1995 | 4.4 | 3.3 | Lebertons un citi, 1999. gads |
1996 | 4.8 | 3.6 | Lebertons, Andrivons, 1998. gads | |
Francija, Šveice | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002. gads |
ASV | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin et al., 1995. gads |
ASV, Zap. Vašingtona | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et al., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ekvadora | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun et al., 1998. gads |
Izraēla | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Krievija, Mosk. novads | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnovs, 1996. gads |
Krievija, dažādi reģioni | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaja un citi. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Primārajām zoosporangijām un zoosporām, kas dīgst oosporām, ir augsta parazītiskās aktivitātes pakāpe, it īpaši, ja oosporas veidojās partenogenētiski celma feromonu ietekmē ar pretēju pārošanās veidu. Tāpēc infekciozais materiāls uz tomātu stādiem, kas audzēti no sēklām, kuras inficētas ar oosporām, ir ļoti patogēns gan tomātiem, gan kartupeļiem.
Šīs izmaiņas izraisīja vēl vienu iedzīvotāju pārstrukturēšanu, kas izteikta šādās nozīmīgās izmaiņās no epidemioloģiskā viedokļa:
- Inficētie tomātu stādi ir kļuvuši par svarīgu kartupeļu primārās infekcijas avotu (Filippovs, Ivanyuk, personiskie ziņojumi).
- Epifitoties uz kartupeļiem sāka novērot jau jūnijā, apmēram mēnesi agrāk nekā parasti.
- Kartupeļu stādījumos palielinājās T1 skrējiena procentuālais daudzums, kas iepriekš tur bija sastopams nenozīmīgā daudzumā (Ulanova et al., 2003).
- No tomātu lapām izdalītie celmi vairs neatšķīrās no kartupeļu celmiem ar virulenci uz virulences gēnu kartupeļu diferenciatoriem un agresivitātē sāka pārspēt “kartupeļu” celmus ne tikai tomātiem, bet arī kartupeļiem (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
Tādējādi atšķirību vietā notika populāciju konverģence, vienas populācijas parādīšanās uz diviem saimniekaugiem ar augstu virulenci un agresivitāti pret abām sugām.
Secinājums
Tātad, neraugoties uz vairāk nekā 150 gadus ilgo intensīvo P. infestans pētījumu, bioloģijā, ieskaitot šī kultivēto viengadīgo augu vissvarīgāko slimību ierosinātāja populācijas bioloģiju, daudz kas vēl nav zināms. Nav skaidrs, kā atsevišķu dzīves cikla posmu pāreja ietekmē populāciju struktūru, kādi ir kanalizētas agresivitātes un virulences mainīguma ģenētiskie mehānismi, kāda ir reproduktīvās un klonālās reproduktīvās sistēmas attiecība dabiskajās populācijās, kā tiek pārmantota veģetatīvā nesaderība, kāda ir kartupeļu un tomātu loma šo kultūru primārajā infekcijā kāda ir to ietekme uz parazītu populācijas struktūru. Līdz šim tādi svarīgi praktiski jautājumi kā ģenētiskie mehānismi parazīta agresivitātes maiņai vai nespecifiskas kartupeļu rezistences erozija nav atrisināti. Padziļinoties un paplašinoties kartupeļu vēlīnās pūtes pētījumiem, parazīts pētniekiem rada jaunus izaicinājumus. Tomēr eksperimentālo spēju uzlabošana, jaunu metodoloģisku pieeju parādīšanās manipulācijām ar gēniem un olbaltumvielām ļauj cerēt uz veiksmīgu uzdoto jautājumu risinājumu.
Raksts tika publicēts žurnālā "Potato Protection" (3. gada 2017. nr.)